Summary

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Published: June 23, 2013
doi:

Summary

Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.

Abstract

Protezione contro le malattie infettive è mediato dal sistema immunitario 1,2. Linfociti T sono coordinatori del master del sistema immunitario, regolando l'attivazione e risposte di molteplici cellule immunitarie 3,4. Attivazione delle cellule T dipende dal riconoscimento di antigeni specifici mostrata dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) è specifico per ogni clone di cellule T e determina specificità antigenica 5. Il legame del TCR all'antigene induce la fosforilazione di componenti del complesso TCR. Al fine di promuovere l'attivazione delle cellule T, questo segnale deve essere trasdotte dalla membrana al citoplasma e il nucleo, avviando varie risposte cruciali quali l'assunzione di proteine ​​di segnalazione al TCR; sito APC (sinapsi immune), la loro attivazione molecolare, riarrangiamento del citoscheletro, elevazione della concentrazione intracellulare di calcio, e cambiamenti nell'espressione genica 6,7. La corretta initiation e la cessazione dei segnali di attivazione è di fondamentale importanza per le risposte delle cellule T del caso. L'attività delle proteine ​​di segnalazione dipende la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina, post traduzionali come fosforilazione proteica, formazione di complessi proteici, ubiquitinazione proteica e l'assunzione di proteine ​​a vari siti cellulari 8. Comprendere il funzionamento interno del processo di attivazione delle cellule T è fondamentale sia per la ricerca immunologica e applicazioni cliniche.

Vari test sono stati sviluppati al fine di indagare le interazioni proteina-proteina, tuttavia, saggi biochimici, come ad esempio il metodo di co-immunoprecipitazione ampiamente utilizzato, non consentono posizione proteina di essere discerne, precludendo così l'osservazione di preziose informazioni sulla dinamica del cellulare meccanismi. Inoltre, questi test di massa di solito si combinano proteine ​​da molte cellule diverse che potrebbero essere in diverse fasi di tindagò processo cellulare. Questo può avere un effetto negativo sulla risoluzione temporale. L'uso di immagini in tempo reale delle cellule vive permette sia il tracking spaziale delle proteine ​​e la capacità di distinguere temporalmente tra eventi di segnalazione, che perde così in luce la dinamica del processo di 9,10. Presentiamo un metodo di imaging in tempo reale della formazione di segnalazione-complesso durante l'attivazione delle cellule T. T-cellule primarie o linee di cellule T, come Jurkat, vengono trasfettate con plasmidi codificanti per proteine ​​di interesse fuse ad proteine ​​fluorescenti monomeriche, impedendo oligomerizzazione non fisiologico 11. Diretta cellule T sono sceso sopra un coprioggetto pre-rivestite con cellule T attivante 8,9 anticorpo, che si lega al complesso CD3/TCR, indurre l'attivazione delle cellule T superando la necessità di antigeni attivatori specifici. Cellule attivate sono costantemente ripreso con l'uso della microscopia confocale. Dati di imaging vengono analizzati per produrre risultati quantitativi, quali il collecoefficiente ocalization delle proteine ​​di segnalazione.

Protocol

1. Trasfezione di cellule T Preparare la soluzione Nucleofector Amaxa attivato mescolando soluzione "Supplemento" del kit per la soluzione Nucleofector. La soluzione attivata può essere conservato a 4 ° C per tre mesi. Coltivare le cellule Jurkat in mezzo di coltura [10% siero fetale di vitello (FCS), soluzione di penicillina-streptomicina 1%, e 2 mM L-glutammina in RPMI]. In modo ottimale, le cellule devono essere utilizzati 1-2 settimane dopo lo scongelamento. Utilizzando colture di ce…

Representative Results

Vi presentiamo un esempio di immagini di cellule T in diretta e analisi. Prima dell'esperimento di imaging, SLP76 cellule T deficienti (J14) sono stati analizzati con l'uso di FACS per determinare l'espressione delle proteine ​​fluorescenti (Figura 1). Cellule T trasfettate con le proteine ​​di segnalazione con tag MCFP-NCK e SLP76-PFP sono stati depositati su vetrini Attivazione e ripreso durante cellule T spreading (Figura 2). Immagini raccolte mostrano le dinamich…

Discussion

La regolazione e la funzione di molteplici processi cellulari dipendono la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina. L'imaging microscopico consente il tracciamento in tempo reale delle proteine ​​fluorescenti tag nelle cellule viventi. Colocalizzazione di proteine ​​marcate può suggerire una interazione diretta o indiretta tra le proteine, e può essere utilizzato per rafforzare i risultati ottenuti con metodi biochimici, come la immunoprecipitazione. A differenza dei metodi biochimici…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Sophia fritto per l'assistenza tecnica. MBS ringrazia i seguenti agenzie per il sostegno della ricerca: La Fondazione Israel Science per le sovvenzioni no.1659/08, 971/08 1503/08 e 491/10, i Ministeri della Salute e della Scienza per le sovvenzioni non. 3-4114 e 3-6540, la Israel Cancer Association attraverso la Tenuta del compianto Alexander Smidoda, e la Fondazione Famiglia Taubenblatt per la borsa di eccellenza Bio-medicina.

Materials

Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002  
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432  
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058  
FCS HyClone SV30160.03  
G418 Calbiochem 345810  
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382  
HCl Bio Lab 8410501  
Hepes Biological Industries 03-025-1B  
Hygromycin Enzo ALX-380-306  
L-glutamine Sigma G7513  
PBS (10X) Sigma D1408  
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781  
Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O Sigma P8920  
RPMI Sigma R8758  
Sodium azide Sigma S2002  
Equipment      
Accublock digital dry bath Labnet D1105A  
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R  
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta  
Heatable mounting frame – Heating Insert P S PeCon 130-800-031  
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000  
Electroporation device Amaxa Nucleofector I  
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE  
Image analysis software Bitplane 7.0.0  

References

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Cite This Article
Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

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