عبر التشابك تتبع من الأهداف الطرفية مع فيروس داء الكلب الكاذب تلاه سهم الكوليرا السمية والمعقدة البيروكسيديز ديكستران الأمينات مزدوجة وصفها
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج يستخدم بشكل مكثف في الدماغ من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV) 1. PRV لا تصيب القردة العليا، بما في ذلك البشر، لذلك فإن استخدامها الأكثر شيوعا في الدراسات على الثدييات الصغيرة، وخاصة القوارض. وPRV152 الكاذب سلالة يعبر عن تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) مراسل الجينات ويعبر فقط نقاط الاشتباك العصبي وظيفية retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 2،3. سلالات PRV أخرى لها خصائص الميكروبيولوجية متميزة ويمكن نقلها في كلا الاتجاهين (PRV-بيكر وPRV-كابلان) 4،5. وهذا البروتوكول يتعامل حصرا مع PRV152. من خلال تقديم الفيروس في موقع الطرفية، مثل العضلات، فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى ركان الدماغ من خلال مجموعة محددة من الخلايا العصبية. النمط الناتج من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم يحل الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية. لأن طبيعة وزعت من تتبع عبر التشابك مع فيروس داء الكلب الكاذب يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الشبكة التي تم تحديدها من الصعب، نقدم طريقة حساسة وموثوق بها توظيف الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والكوليرا السم الوحيدات ب (CTB) لتأكيد صلات بين الخلايا التي تم تحديدها باستخدام PRV152. وقد تم اختيار كشف مناعى من BDA وCTB مع الغلوثانيون وDAB (3، 3'-diaminobenzidine) لأنها فعالة في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 11/06.
Introduction
أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج الأكثر استخداما على نطاق واسع في الدماغ القوارض من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV)، وخصوصا سلالة ضعيفة PRV-بارثا صفت لأول مرة في عام 1961 (12). وهنا، نقدم بروتوكول لتحديد التمثيل القشرية الحركية للعضلات محددة أو المجموعات العضلية باستخدام سلالة فيروس داء الكلب الكاذب المؤتلف (PRV152) معربا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) مراسل الجين 2. الطريقة الموصوفة يستغل سلوك الفيروسات موجه للعصب، والتي تنتج ذرية المعدية التي تصيب لنقاط الاشتباك العصبي عبر الخلايا العصبية الأخرى داخل الدائرة الفنية 3،4،13. PRV152، وهو إسوي مع PRV-بارثا، والصلبان فقط نقاط الاشتباك العصبي retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 3،5 </ سوب>. عن طريق التحكم بدقة الموقع الطرفية للعدوى فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى الدماغ من خلال مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية الحركية. كما يصيب فيروس بالتتابع سلاسل من الخلايا العصبية متصلة، فإن نمط الناتجة من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم حل شبكة من الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية.
ميزة إضافية لاستخدام الفيروسات لتتبع العصبي هو التضخيم من البروتين مراسل (EGFP في هذه الحالة) داخل الخلايا المصابة. يوفر هذا التضخيم إشارة مستوى من الحساسية التي تتيح الكشف عن التوقعات حتى متفرق. على سبيل المثال، تم العثور على إسقاط متفرق من القشرة شعرة أنفية المحرك إلى الخلايا العصبية الحركية في الوجه السيطرة على شعيرات في الفئران باستخدام أعرب فيروسي بروتين الفلورية الخضراء 14؛ فشلت الدراسات السابقة للعثور على هذا الإسقاط باستخدام استشفاف الكلاسيكية دون مراسل التضخيم الجينات 11،15. لسوء الحظ، والعديد من ناقلات تتبع الفيروسية، مثل تلك المستخدمة في الدراسة المذكورة، لا يعبرون نقاط الاشتباك العصبي، مما يحد من استخدامها لتعقب الدوائر المتعددة متشابك.
بينما تقدم مزايا واضحة لتحديد شبكة من الخلايا المشاركة في الدائرة الحركية، وطبيعة توزيع عبر التشابك البحث عن المفقودين مع PRV-152 يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الدائرة الصعبة. ولذلك، فإننا نقدم وسيلة بسيطة للتحقق من صحة اتصالات محددة داخل الدوائر التي تم تحديدها باستخدام PRV-152 عن طريق مزدوج وضع العلامات باستخدام الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والسمية الكوليرا الوحيدات ب (CTB). الجمع بين استخدام BDA وCTB هو نهج راسخ لتعقب الاتصالات بين مجموعات محددة من الخلايا العصبية 6-8،11. عند استخدامها معا، وهذه استشفاف اثنين يمكن تصور في نفس القسم باستخدام DAB اللونين (3، 3'-diaminobenzidine) إجراء 16. وقد تم اختيار ارتفاع الوزن الجزيئي BDA (BDA10kDa) لهذا البروتوكول لأنه ذields وضع العلامات مفصل من العمليات العصبية 6،7،9. وتشمل مزايا إضافية من BDA10kDa ما يلي: يتم نقل تفضيلي في الاتجاه تقدمي 6-8. يمكن أن يتم تسليمها من قبل iontophoretic أو ضغط الحقن 6-8. ويمكن تصور كتبها a-البيروكسيديز أفيدين HRP بسيط (ABC) إجراء 17؛ ويمكن تصويرها بواسطة الضوء أو المجهر الإلكتروني 6،7،18. وقد تم اختيار كشف مناعى من CTB مع الغلوثانيون وDAB لوضع العلامات رجعي من العصبونات الحركية لأنه فعال في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 10،19. كنا مؤخرا هذا النهج لتحديد مسار السيارات صخبا في الفئران وللكشف عن اتصال متفرق من القشرة الحركية الأولية إلى الخلايا العصبية الحركية الحنجرة، والتي كان من المفترض سابقا أن تغيب 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك عدد من القضايا التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند التخطيط لتجربة استخدام PRV152 4،21. الأهم من ذلك، فيروس داء الكلب الكاذب قاتلة. كما ذكر سابقا، القردة العليا، بما في ذلك البشر ليست عرضة للإصابة، ولكن يجب توخي الحذر المناسبة لحماية الحيوانات الأخرى. فئران بال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور توشيو Terashima من جامعة كوبي، اليابان، لتدريس تقنية جراحة الحنجرة، والدكتور لين Enquist من جامعة برينستون لتوريد PRV-بارثا. وأيد البحث من قبل جائزة الرواد NIH DP1 OD000448 لإريك D. جارفيس وجائزة زمالة أبحاث NSF العليا لغوستافو آرياغا. وتستخدم الأرقام من الأعمال السابقة الفضل بشكل مناسب تحت بلوس وان الوصول المفتوح جميل الترخيص (CC-BY) وفقا لسياسات التحرير في المجلة.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
