Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies'e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV) 1 kullanılarak beyinde kullanılmaktadır. PRV insanlar dahil olmak üzere büyük maymunları enfekte etmez, bu yüzden en yaygın küçük memeliler, özellikle kemirgenler üzerinde çalışmalarda kullanılmaktadır. Pseudorabies zorlanma PRV152 gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) raportör geni ifade ve sadece retrograd uzak enfeksiyon sitesinden 2,3 sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi ile fonksiyonel sinapsların geçer. Diğer PRV suşları farklı mikrobiyolojik özelliklere sahip ve her iki yönde (PRV-Becker ve PRV-Kaplan) 4,5 'de taşınabilir. Bu protokol PRV152 münhasıran ele alacağız. Böyle kas gibi, periferik yerinde virüsü teslim ederek, t içine virüsün girişini sınırlamak mümkündürnöronların belirli bir set üzerinden beyni. Beyin boyunca eGFP sinyalinin elde edilen şablon, bu durumda başlangıçta enfekte olan hücrelere bağlı nöronların giderir. Pseudorabies virüs transsinaptik izleme dağıtık yapısı zor bir tanımlanmış bir ağ içinde belirli bağlantı yorumlama yapar, biz kullanılarak tespit hücreleri arasındaki bağlantıları teyit için biyotinli dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak hassas ve güvenilir bir yöntem sunmak PRV152. Onlar uzak dendritler 6-11 olmak üzere hücresel süreçleri ortaya etkilidir çünkü peroksidaz ve DAB (3, 3'-diaminobenzidin) ile BDA ve CTB immunokimyasal tespiti seçildi.
Introduction
Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın, özellikle zayıflatılmış suş PRV-Bartha ilk kez 1961 yılında açıklanan domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV), kullanılarak kemirgen beyinde kullanılmaktadır 12. Burada, belirli kasların motor kortikal temsilini belirlemek için bir protokol mevcut veya gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) raportör geninin 2 eksprese eden bir rekombinant pseudorabies virüs suşu (PRV152) ile kas grupları. Açıklanan yöntem çapraz sinaps fonksiyonel devre 3,4,13 içindeki diğer nöronlar bulaştırmak için bu bulaşıcı döl üreten nörotropik virüsler, davranışını patlatır. PRV-Bartha ile izojenik olan PRV152, sadece uzak enfeksiyon sitesinden 3,5 <dan retrograd sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi boyunca sinaps haçlar/ sup>. Tam olarak enfeksiyonun periferal sitesi kontrol edilmesiyle motor nöronların spesifik bir alt kümesi üzerinden beyne virüs girişini sınırlamak mümkündür. Virüs sırayla bağlı nöronların zincirlerini bozar gibi, beynin boyunca eGFP sinyalinin ortaya çıkan desen sonra başlangıçta enfekte hücrelere bağlı olan nöronların ağı çözecektir.
Nöral izleme için virüs kullanılarak bir başka avantajı, enfekte olmuş hücreler içinde raportör proteininin (bu durumda EGFP) amplifikasyonu olup. Bu sinyal amplifikasyon bile seyrek projeksiyonlar algılanmasını sağlar duyarlılık düzeyi sağlar. Örneğin, bıyık kontrol yüz motor nöronlara bıyık motor korteks bir seyrek projeksiyon viral ifade yeşil flüoresan protein 14 ile sıçanlarda bulundu; önceki çalışmalar raportör gen amplifikasyonu 11,15 olmadan klasik izleyiciler kullanarak bu projeksiyonu bulamadılar. Ne yazık kiBirçok viral izleme vektörleri belirtilen çalışmada kullanılan gibi, bu şekilde, çok-sinaptik devreleri izlemek için kullanımlarını sınırlamaktadır sinaps geçmez.
Motor devresinde katılan hücrelerin ağını tanımlamak için farklı avantajlar sunarken, transsinaptik dağıtık yapısı PRV-152 zorlu devre içinde belirli bağlantıları yorumlama yapar ile izleme. Bu nedenle, biz biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak çift etiketleme PRV-152 kullanılarak tespit devreler içinde belirli bağlantıları doğrulamak için basit bir yöntem mevcut. BDA ve CTB kombine kullanımının nöronlar 6-8,11 özel setler arasındaki bağlantıları izlemek için köklü bir yaklaşımdır. Birlikte kullanıldığında, bu iki izleyiciler iki renkli DAB (3, 3'-diaminobenzidin) prosedürü 16 kullanarak aynı bölümünde görülebilir. Yüksek molekül ağırlıklı BDA (BDA10kDa) bu protokol için seçildi bu y çünkünöron 6,7,9 ayrıntılı etiketleme ields. BDA10kDa diğer avantajları arasında aşağıdakiler bulunmaktadır: bu tercihan anterograd yönünde 6-8 taşınır; o iyontoforetik veya basınçlı enjeksiyon 6-8 teslim edilebilir; basit bir avidin biotinillenmemiş HRP (ABC) prosedürü 17 tarafından görüntülenmiştir olabilir; ve ışık veya elektron mikroskobu 6,7,18 tarafından görüntülenebilir. Distal dendritler 10,19 gibi hücresel süreçleri ortaya çıkartılmasında etkili olduğu için peroksidaz ve DAB ile CTB immünokimyasal algılama motor nöronlar retrograd etiketlenmesi için seçildi. Biz son zamanlarda farelerde vokal motorlu yolu belirlemek ve daha önce 20 eksik olarak kabul edildi laringeal motor nöronların, primer motor korteks gelen seyrek bir bağlantı ortaya çıkarmak için bu yaklaşımı kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
PRV152 4,21 kullanarak bir deney planlanırken dikkate alınması gereken konulardan bir dizi vardır. Daha da önemlisi, pseudorabies virüs öldürücü. Daha önce belirtildiği gibi, insanlar da dahil olmak üzere büyük maymunlar, enfeksiyona duyarlı değildir, ancak uygun bakım diğer hayvanları korumak için dikkatli olunmalıdır. Yetişkin farelerde tipik haliyle beş ila yedi gün, zayıflatılmış PRV152 suşu ile aşılamadan sonra hayatta. Bu nedenle, PRV152 bir haftadan daha uzun bir hayatt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz laringeal cerrahi tekniği öğretmek için, Kobe Üniversitesi, Japonya Dr. Toshio Terashima teşekkür ve PRV-Bartha temini için Princeton Üniversitesi'nden Dr. Lynn Enquist. Araştırma Erich Jarvis D. NIH öncü ödülü DP1 OD000448 ve Gustavo Arriaga bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu ödülü ile desteklenmiştir. Uygun kredili önceki çalışmalarından Rakamlar derginin editoryal politikalarına uygun PLoS ONE açık erişim Creative Commons lisansı (CC-BY) altında kullanılmaktadır.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
