Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque ha sido utilizado más extensivamente en el cerebro mediante la utilización del virus de la pseudorrabia porcina patógenos (PRV) 1. PRV no infecta a los grandes simios, incluidos los humanos, por lo que es más comúnmente utilizado en estudios de pequeños mamíferos, especialmente roedores. El PRV152 seudorrabia cepa expresa la proteína fluorescente (EGFP) gen indicador verde mejorado y sólo cruza la sinapsis funcionales retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia desde el sitio de la infección 2,3. Otras cepas PRV tienen propiedades microbiológicas distintos y pueden ser transportados en ambas direcciones (PRV-Becker y PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo se ocupará exclusivamente de PRV152. Al entregar el virus en un lugar periférico, tales como el músculo, es posible limitar la entrada del virus en tque el cerebro a través de un conjunto específico de neuronas. El patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro a continuación, resuelve las neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Como la naturaleza distribuida de rastreo transináptico con el virus de la pseudorrabia hace interpretar conexiones específicas dentro de una red identificada difícil, presentamos un método sensible y fiable empleando aminas biotina dextrano (BDA) y la toxina del cólera subunidad B (CTB) para confirmar las conexiones entre las células identificadas utilizando PRV152. Detección inmunoquímica de BDA y CTb con peroxidasa y DAB (3, 3'-diaminobencidina) fue elegido porque son eficaces a revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 6-11.
Introduction
Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque se ha utilizado más ampliamente en el cerebro de roedores utilizando el virus de la pseudorrabia patógenos porcina (PRV), especialmente la cepa atenuada PRV-Bartha describió por primera vez en 1961 12. A continuación, presentamos un protocolo para la identificación de la representación cortical motora de los músculos específicos o grupos musculares utilizando una cepa del virus de la pseudorrabia recombinantes (PRV152) que expresa el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) gen informador 2. El método descrito explota el comportamiento de los virus neurotróficos, que producen progenie infecciosa que las sinapsis transversales para infectar otras neuronas dentro de un circuito funcional 3,4,13. PRV152, que es isogénica con PRV-Bartha, solamente cruza la sinapsis retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia del sitio de la infección 3,5 </ sup>. Al controlar con precisión el sitio periférico de la infección es posible limitar la entrada del virus en el cerebro a través de un subconjunto específico de las neuronas motoras. A medida que el virus infecta secuencialmente cadenas de neuronas conectadas, el patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro entonces resolver la red de neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente.
Una ventaja adicional del uso de virus para el rastreo neural es la amplificación de la proteína indicadora (eGFP en este caso) dentro de las células infectadas. Esta amplificación de la señal proporciona un nivel de sensibilidad que permite la detección de proyecciones incluso dispersos. Por ejemplo, una proyección de escasa corteza motora Vibrisas a las neuronas motoras faciales que controlan los bigotes se encontró en ratas utilizando la proteína fluorescente verde de forma viral expresado 14; estudios previos no lograron encontrar esta proyección utilizando trazadores clásicos sin amplificación del gen reportero 11,15. Desafortunadamente, Muchos vectores virales de rastreo, como el usado en el estudio citado, no se cruzan las sinapsis, lo que limita su uso para el rastreo de circuitos multi-sinápticas.
Al presentar distintas ventajas para la identificación de la red de las células que participan en un circuito del motor, la naturaleza distribuida de transináptico rastreo con PRV-152 hace que la interpretación de conexiones específicas dentro del circuito difícil. Por lo tanto, se presenta un método simple para la validación de las conexiones específicas dentro de los circuitos identificados con PRV-152 haciendo doble etiquetado utilizando aminas biotina dextrano (BDA) y la subunidad toxina del cólera b (CTB). El uso combinado de BDA y CTb es un enfoque bien establecido para el rastreo de conexiones entre conjuntos específicos de neuronas 6-8,11. Cuando se usan juntos, estos dos marcadores se pueden visualizar en la misma sección usando un DAB de dos colores (3, 3 '-Diaminobencidina) Procedimiento 16. De alto peso molecular BDA (BDA10kDa) fue seleccionado para este protocolo, ya que yields etiquetado detallado de los procesos neuronales 6,7,9. Las ventajas adicionales de BDA10kDa incluyen los siguientes: se transporta preferentemente en la dirección anterógrada 6-8; puede ser entregado por iontoforesis o la inyección de presión 6-8; se puede visualizar con un simple HRP avidina-biotina (ABC) procedimiento 17; y puede ser fotografiado por la luz o microscopía electrónica 6,7,18. Detección inmunoquímica de CTb con peroxidasa y DAB fue elegido para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras, ya que es eficaz en revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 10,19. Recientemente hemos utilizado este enfoque para identificar la vía motora vocal en ratones y revelar una conexión escasa de la corteza motora primaria de las neuronas motoras de la laringe, que fue asumido previamente a estar ausente 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay una serie de cuestiones que deben tenerse en cuenta al planificar un experimento utilizando PRV152 4,21. Lo más importante, virus de la pseudorrabia es letal. Como se mencionó anteriormente, los grandes simios, incluidos los seres humanos no son susceptibles a la infección, pero la atención adecuada deben ejercerse para proteger a otros animales. Los ratones adultos normalmente sobreviven cinco a siete días después de la inoculación con la cepa atenuada PRV152. Por lo tanto, PRV152 no es apropiado …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Toshio Terashima de la Universidad de Kobe, Japón, para la enseñanza de la técnica de la cirugía laríngea, y el Dr. Lynn Enquist de la Universidad de Princeton para el suministro de PRV-Bartha. La investigación fue apoyada por Pioneer Award NIH DP1 OD000448 a Erich D. Jarvis y un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Las cifras del anterior trabajo debidamente acreditado se utilizan bajo la PLoS ONE acceso abierto licencias Creative Commons (CC-BY), de conformidad con las políticas editoriales de la revista.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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