Transsynaptic tracing은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중심 원심성을 분석하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. 여기에서는 시냅스경이 횡단하는 광견병 바이러스를 활용하여 기능적인 뇌 회로를 식별하고 국소화하는 프로토콜을 제시한 다음, 식별된 뉴런 그룹 간의 회로에서 특정 연결을 검증하기 위한 고전적인 요로 추적 기술을 제시합니다.
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방법 논문
Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적
이 논문에서
요약
초록
Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 접근법은 가장 광범위 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV) (1)을 이용하여 뇌에 사용되어왔다. PRV는 인간을 비롯한 영장류를 감염시키지 않으므로 가장 일반적으로 작은 포유류, 특히 설치류 연구에 사용된다. (僞) 균주 PRV152는 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 리포터 유전자를 발현하고 만 역행 떨어져 감염 부위에서 2,3- 시냅스 연결의 계층 순서를 기능적 시냅스 십자가. 기타 PRV 균주는 별개의 미생물 학적 특성을 가지고 두 방향 (PRV-베커와 PRV-카플란) 4,5에서 전송 될 수있다. 이 프로토콜은 PRV152 독점적으로 다룰 것이다. 근육과 같은 말초 부위에서 바이러스를 제공함으로써, t로 바이러스의 침입을 제한 할 수있다뉴런의 특정한 세트를 통해 그 뇌. eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 연결된 뉴런을 해결. (僞) 바이러스와 transsynaptic 추적의 분산 특성이 어려운 식별 된 네트워크 내에서 특정 연결을 해석한다, 우리는 사용하여 식별 세포 사이의 연결을 확인하기위한 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 서브 유닛 B (CTB)를 사용하는 민감하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다 PRV152. 그들은 말초 돌기 6-11 포함한 세포 과정을 계시하는데 효과적이기 때문에 옥시다아제 및 DAB (3,3'- 디아 미노)와 BDA 및 CTB의 면역 검출을 선택 하였다.
서론
Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 방법은 가장 광범위 특히 약독 화 균주 PRV-Bartha은 1961에서 설명 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV)을 이용하여 쥐의 뇌에서 사용되어왔다 (12). 여기서는 특정 근육의 운동 피질 표현을 식별하기위한 프로토콜을 제시 또는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 2 리포터 유전자 발현 (僞) 재조합 바이러스 균주 (PRV152)를 사용하여 근육 그룹. 한 방법은 간 시냅스가 기능 회로 3,4,13 내의 다른 신경 세포를 감염시킬 것을 전염성 자손을 생산 neurotropic 바이러스의 동작을 이용한다. PRV-Bartha과 동종이다 PRV152은 단지 거리에 감염 사이트 3,5 <에서 역행 시냅스 연결의 계층 순서를 통해 시냅스를 교차/ SUP>. 정확하게 감염의 외주 위치를 제어함으로써, 그 운동 뉴런의 특정 서브 세트를 통해 뇌에 바이러스의 침입을 제한 할 수있다. 바이러스 순차적으로 연결된 뉴런의 체인을 감염 같이, eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 접속되어 신경 네트워크를 해결할 것이다.
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프로토콜
참고 : 모든 동물 절차를 검토하고 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 보관 (僞) 바이러스
- 우리는 1 × 109 PFU / m의 역가에 프린스턴 대학에서 박사 린 Enquist의 실험실에서 라이브 바이러스 (PRV152)을 얻었다. 바이러스를 생성하는 2 프로토콜을 발표되었다.
- 적절한 바이오 안전성 조건에서 -80 ° C에서 BSL-2 바이오 안전성 캐비닛과 가게 내부 튜브 당 20 μL에서 바이러스를 나누어지는.
- 바로 주입하기 전에 PRV의 나누어지는을 녹여.
근육에 주사 2. 수술 준비
- (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다.
- 안과 연고와 각막을 보호합니다.
- T 준비머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 수술 부위를 소독하여 무균 기술에 따라 그 수술 부위. 수술 영역을 커버하는 멸균 커튼을 사용하십시오. 절차 전....
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결과
eGFP는 위해 염색하는 것은 근육에 PRV152를 주입 한 후 일차 운동 뉴런에 약 72 시간을 약한 신호를 보여주는 시작해야한다. 복제 및 바이러스의 transsynaptic 교통 titer-과 시간에 따라 4입니다. 약 90 시간 주입 후, eGFP는 염색은 2 차 순서에 감염된 세포에 강력한 신호를 공개합니다. 긴 생존 시간은 3 차 및 고차 세포를 공개하지만 생존 시간은 약 오일 접종 후 PRV의 치사에 의해 제한됩니다.
그림 1a는 PRV152는 후두 운동 신경, 일곱 후두 근육의 두 가지로 PRV152의 주사 후 94 시간 주택 핵 ambiguus에 eGFP는 표현에 감염된 신경을 보여줍니다. 바이러스가 감염된 근육, 같은 설하 핵 다른 phonatory 운동 신경 풀을, 신경을 분포시키다 신경을 통해 뇌에 입력하기 때문에, eGFP는을 표명하지 아니합니다 (그.......
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토론
PRV152 4,21 이용한 실험을 계획 할 때 고려되어야 문제들이있다. 가장 중요한 것은, (僞) 바이러스는 치명적이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 인간을 비롯한 영장류가 감염에 민감하지 않지만 적절한주의가 다른 동물을 보호하기를 기울여야한다. 성인 마우스는 일반적으로 5-7일 감쇠 PRV152 균주 접종 후 생존. 따라서, PRV152 1 주일 이상 생존 시간을 필요로 실험에 적합하지 않습니다. 또한, 감염된 동물은 일반적으로하여 정상적인 동작의 관찰을 필요로하는 실험 PRV152의 유용성을 제한, 생존 기간 동안 질병의 징후를 표시합니다.
또한, PRV152는 세포 독성 면역 반응 (22)을 트리거합니다. 바이러스의 복제 및 전송 시간에 따른 4 titer-하고 있기 때문에, 신경의 패턴 비라의 면역 검출에 의해 밝혀세포는 감염의 단계를 통해 진행으로 L 단백질 또는 eGFP는 리포터 유전자는 생존 기간의 과정을.......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
우리는 후두 수술 기술을 가르치는, 고베 대학, 일본의 박사 토시오 테라지마 감사와 PRV-Bartha를 공급하는 프린스턴 대학의 박사 린 Enquist. 연구는 에리히 D. 자비스에 NIH 개척자 상 DP1 OD000448와 구스타보 Arriaga에 NSF 대학원 연구 활동 상에 의해 지원되었다. 적절하게 적립 이전의 연구에서 수치 저널의 편집 정책에 따라 PLoS의 하나 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 라이선스 (CC-BY)에서 사용된다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약/재료 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| NanoFil microinjection system | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| 슬라이딩 마이크로톰 | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | ||
| Betadine 면봉 스틱 | Cardinal Health | 2130-01 | 200 카운트 |
| Permount 마운팅 매체 | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | 역가 >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg 정제 |
| 에탄올 | 시그마-알드리치 | E7023 | 200 증거 |
| 포름알데히드 | 시그마-알드리치 | F8775 | 4%과산화수소로 희석 |
| 시그마-알드리치 | H3410 | 30% | |
| 케타민 HCl & 자일라진 HCl | 시그마-알드리치 | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| 니켈 클로라이드 | 시그마-알드리치 | 339350 | |
| 인산염 완충액 | 시그마-알드리치 | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| 인산염 완충 식염수 | 시그마-알드리치 | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| 펜토바르비탈 | 나트륨 시그마-알드리치 | P3761 | 50 mg/ml 용량 |
| 자당 | , 시그마-알드리치 | S9378 | |
| 트윈 20 | 시그마-알드리치 | P1379 | |
| 크실렌, | 시그마-알드리치 | , 534056 | 조직학적 등급 |
| VECTASTAIN Elite, ABC 키트 | Vector Laboratories | PK-6101 (토끼); PK-6105 (염소) | |
| 옵틱스케어 안과 연고 | Vet Depot | 1017992 |
참고문헌
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al.
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재인쇄 및 허가
