Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido mais amplamente utilizado no cérebro, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV) 1. O PRV não infectar grandes macacos, incluindo os seres humanos, por isso é mais comumente usado em estudos sobre pequenos mamíferos, especialmente roedores. O PRV152 pseudorabies estirpe expressa a proteína fluorescente (eGFP) gene repórter verde reforçada e só atravessa sinapses funcionais retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas de distância do local da infecção 2,3. Outras estirpes de PRV têm propriedades microbiológicas distintas e pode ser transportado em ambas as direcções (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo tratará exclusivamente com PRV152. Ao fornecer o vírus num sítio periférico, tais como o músculo, é possível limitar a entrada do vírus em tele cérebro através de um conjunto específico de neurônios. O padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida, resolve os neurónios que são ligados às células inicialmente infectadas. Como a natureza distribuída de rastreamento transsináptica com o vírus da pseudo-raiva faz interpretar conexões específicas dentro de uma rede identificada difícil, apresentamos um método sensível e confiável que emprega aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB) para confirmar as conexões entre as células identificadas usando PRV152. Detecção imunoquímica de BDA e CTB e com peroxidase de DAB (3, 3'-diaminobenzidina) foi escolhida, porque eles são eficazes em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 6-11.
Introduction
Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido o mais amplamente utilizado no cérebro de roedor, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV), especialmente a estirpe atenuada de PRV-Bartha descrita pela primeira vez em 1961 12. A seguir, apresentamos um protocolo para a identificação da representação cortical motora dos músculos específicos ou grupos musculares utilizando uma estirpe do vírus da pseudo-raiva recombinantes (PRV152) que expressa o reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) gene repórter 2. O método descrito explora o comportamento de vírus neurotrópico, que produzem progénie infeccioso que sinapses cruzadas para infectar outros neurónios dentro de um circuito funcional 3,4,13. PRV152, que é isogênico com PRV-Bartha, única atravessa sinapses retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas longe do local de infecção 3,5 </ sup>. Ao controlar com precisão o local periférico de infecção é possível limitar a entrada do vírus para o cérebro através de um subconjunto específico de neurónios motores. À medida que o vírus infecta sequencialmente cadeias de neurónios ligados, o padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida resolver a rede de neurónios que estão ligados às células inicialmente infectadas.
Uma vantagem adicional da utilização de vírus, para um rastreio neural é a amplificação da proteína repórter (eGFP, neste caso) no interior das células infectadas. Esta amplificação de sinal fornece um nível de sensibilidade que permite a detecção de projeções ainda esparsas. Por exemplo, uma projecção a partir de córtex motor esparso vibrissa para os neurónios motores faciais que controlam os bigodes foi encontrada em ratos utilizando viralmente expressa a proteína fluorescente verde 14; Estudos anteriores não conseguiram encontrar essa projeção usando marcadores clássicos sem amplificação do gene repórter 11,15. Infelizmente, Muitos vectores virais de rastreio, tal como o utilizado no estudo citado, não atravessam sinapses, limitando assim o seu uso para o rastreamento de circuitos multi-sinápticos.
Ao apresentar vantagens distintas para identificar a rede de células que participam em um circuito de motor, a natureza distribuída da transsináptica rastreamento com PRV-152 torna a interpretação de conexões específicas dentro do circuito difícil. Por isso, apresentamos um método simples para a validação de conexões específicas dentro de circuitos identificados usando PRV-152 by-dupla rotulagem utilizando aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB). O uso combinado do BDA e CTb é uma abordagem bem estabelecido para rastreamento de conexões entre conjuntos específicos de neurônios 6-8,11. Quando utilizados em conjunto, estes dois marcadores podem ser visualizados na mesma secção utilizando um DAB duas cores (3, 3'-diaminobenzidina) Procedimento 16. Alto peso molecular BDA (BDA10kDa) foi selecionada para este protocolo porque yfields rotulagem detalhada dos processos neuronais 6,7,9. As vantagens adicionais da BDA10kDa incluem o seguinte: ele é preferencialmente transportados na direcção anterógrada 6-8; que podem ser entregues por iontoforese ou de injecção a pressão 6-8; que pode ser visualizada por uma simples HRP (ABC) Procedimento 17 biotinilada-avidina; e pode ser fotografada pela luz ou microscopia eletrônica 6,7,18. Detecção imunoquímica da CTB com peroxidase e DAB foi escolhido para a marcação retrógrada de neurónios motores, pois é eficaz em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 10,19. Nós recentemente utilizado esta abordagem para identificar a via motora vocal em camundongos e para revelar uma conexão escasso de córtex motor primário para os neurônios motores da laringe, que foi previamente assumidos estar ausente 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há uma série de questões que devem ser levadas em consideração ao planejar uma experiência usando PRV152 4,21. Mais importante ainda, vírus da pseudo é letal. Como mencionado anteriormente, grandes macacos, incluindo os seres humanos não são suscetíveis à infecção, mas cuidado apropriado deve ser exercido para proteger outros animais. Ratos adultos normalmente sobreviver cinco a sete dias após a inoculação com a estirpe atenuada PRV152. Portanto, PRV152 não é adequado para experiências que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Toshio Terashima, da Universidade de Kobe, no Japão, para o ensino da técnica de cirurgia de laringe, e Dr. Lynn Enquist da Universidade de Princeton para o fornecimento de PRV-Bartha. A pesquisa foi financiado pelo NIH prêmio pioneiro DP1 OD000448 para Erich D. Jarvis e um prêmio NSF Graduate Research Fellowship para Gustavo Arriaga. Dados do adequadamente creditado trabalho anterior são usadas sob a PLoS ONE acesso aberto licença Creative Commons (CC-BY), em conformidade com as políticas editoriais da revista.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
