Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV) 1. PRV לא להדביק קופים גדולים, כולל בני אדם, כך שזה הוא נפוץ ביותר במחקרים על יונקים קטנים, בעיקר מכרסמים. PRV152 מתח pseudorabies מבטא את חלבון פלואורסצנטי הגן המשופר הירוק (eGFP) כתב ורק חוצה סינפסות הפונקציונלית retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 2,3. יש זני PRV אחרים מאפייני מיקרוביולוגים שונים ויכולים להיות מועברים בשני הכיוונים (PRV-בקר וPRV-קפלן) 4,5. פרוטוקול זה יעסוק באופן בלעדי עם PRV152. על ידי אספקת הווירוס באתר היקפי, כגון שרירים, ניתן להגביל את כניסתם של הווירוס לתוך tהוא המוח באמצעות סדרה ספציפית של נוירונים. הדפוס וכתוצאה מכך של אות eGFP בכל רחבי המוח אז פותר את הנוירונים הקשורים לתאים הנגועים בתחילה. כטבע חילק של מעקב transsynaptic עם pseudorabies וירוס גורם לפרש חיבורים ספציפיים בתוך רשת מזוהה קשה, אנו מציגים שיטה רגישה ואמינה המעסיקה אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB) למאשרים את הקשרים בין התאים המזוהים באמצעות PRV152. זיהוי immunochemical של BDA וCTB עם peroxidase וDAB (3, 3'-diaminobenzidine) נבחר בגלל שהם יעילים בחושפים תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 6-11.
Introduction
מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח המכרסמים על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV), במיוחד הזן המוחלש PRV-ברטה שתוארה לראשונה בשנת 1961 12 כאן., אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי הייצוג בקליפת המוח המוטורי של שרירים ספציפיים או קבוצות שרירים באמצעות מתח pseudorabies רקומביננטי וירוס (PRV152) המבטא את גן כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק המשופר (eGFP) 2. השיטה המתוארת מנצלת את ההתנהגות של וירוסי neurotropic, אשר מייצרים צאצאים זיהומיות שסינפסות הצלב להדביק נוירונים אחרים בתוך מעגל פונקציונלי 3,4,13. PRV152, שהוא isogenic עם PRV-ברטה, רק חוצה סינפסות retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 3.5 </ Sup>. על ידי שליטה מדויקת באתר ההיקפי של זיהום ניתן להגביל את הכניסה של הווירוס למוח דרך משנה ספציפי של הנוירונים מוטוריים. כרצף הווירוס מדביק רשתות של תאי עצב מחוברים, וכתוצאה מכך הדפוס של אות eGFP בכל רחבי המוח לאחר מכן לפתור את הרשת של נוירונים המחוברים לתאים הנגועים בתחילה.
יתרון נוסף של שימוש בוירוס למעקב עצבי הוא ההגברה של חלבון הכתב (eGFP במקרה זה) בתאים נגועים. הגברה אות זו מספקת רמת הרגישות המאפשרת זיהוי של תחזיות אפילו דלילות. לדוגמא, הקרנה דלילה מהקורטקס מוטורי vibrissa לתאי העצב מוטורי פנים השליטה השפם נמצאה בחולדות באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הביע באופן ויראלי 14; מחקרים קודמים לא הצליחו למצוא הקרנה זה באמצעות קליעים נותבים קלאסיים בלי ההגברה גן כתב 11,15. לרוע המזל, רבים וקטורי מעקב נגיפיים, כמו זה המשמש במחקר המצוטט, לא לחצות סינפסות, וכך להגביל את השימוש בם לאיתור מעגלים רב-סינפטי.
תוך הצגת יתרונות ברורים לזיהוי הרשת של תאים המשתתפים במעגל מנוע, הטבע ממוינות transsynaptic התחקות עם PRV-152 הופך את פרשנות חיבורים ספציפיים בתוך המעגל הקשה. לכן, אנו מציגים שיטה פשוטה לאימות חיבורים ספציפיים בתוך מעגלים זוהו באמצעות PRV-152 על ידי דו-תיוג באמצעות אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB). השימוש בשילוב של BDA וCTB הוא גישה מבוססת היטב לאיתור קשרים בין קבוצות הספציפיות של נוירונים 6-8,11. כאשר נעשה שימוש יחד, ניתן דמיינו שני קליעים נותבים אלה באותו הסעיף באמצעות DAB שני צבעים (3, 3'-diaminobenzidine) הליך 16. משקל מולקולרי גבוה BDA (BDA10kDa) נבחר לפרוטוקול זה כי זה yields תיוג מפורט של תהליכים עצביים 6,7,9. יתרונות נוספים של BDA10kDa כוללים את הבאים: זה מועבר באופן מועדף בכיוון אנטרוגרדית 6-8; זה יכול להיות מועבר על ידי iontophoretic או הזרקה בלחץ 6-8; ניתן דמיין ידי HRP-biotinylated avidin פשוט (ABC) הליך זה 17; וניתן הדמיתו על ידי אור או מיקרוסקופי אלקטרונים 6,7,18. זיהוי immunochemical של CTB עם peroxidase וDAB נבחר לתיוג מדרדר של motoneurons כי הוא יעיל לגילוי תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 10,19. לאחרונה השתמשו בגישה זו כדי לזהות את המסלול המוטורי הקולי בעכברים ולחשוף חיבור דליל מקליפת המוח מוטורי ראשונית לתאי העצב המוטוריים בגרון, שהונח בעבר להיעדר 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש מספר נושאים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסוי באמצעות PRV152 4,21. והכי חשוב, pseudorabies הווירוס קטלני. כפי שהוזכר קודם לכן, קופים גדולים, כולל בני אדם אינם רגישים לזיהום, אך הטיפול מתאים חייב להיות מופעל כדי להגן על בעלי חיים אחרים. עכברים בוגרים לשרוד בדרך כלל 5-7 ימים לא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר הטושים Terashima של אוניברסיטת קובה, יפן, להוראת טכניקת הניתוח בגרון, וד"ר לין אנקוויסט של אוניברסיטת פרינסטון לאספקת PRV-ברטה. מחקר נתמך על ידי הפרס חלוץ NIH DP1 OD000448 לאריך ד ג'רוויס ופרס NSF בוגר מלגת המחקר לגוסטבו אריאגה. דמויות מהעבודה קודמת זוכה כראוי משמשות תחת רישיון PLoS ONE גישה פתוחה Creative Commons (CC-BY) בהתאם למדיניות העריכה של כתב העת.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
