Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV) 1 verwendet. PRV nicht infizieren, Menschenaffen, einschließlich des Menschen, so dass es am häufigsten in Studien von kleinen Säugetieren, vor allem Nagetiere. Die Pseudorabies-Stamm PRV152 drückt das enhanced green fluorescent protein (eGFP) Reportergen und kreuzt nur funktionierender Synapsen retrograd durch die hierarchische Sequenz der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 2,3. Andere PRV-Stämme haben unterschiedliche mikrobiologischen Eigenschaften und kann in beiden Richtungen (PRV-Becker und PRV-Kaplan) 4,5 transportieren. Dieses Protokoll wird ausschließlich mit PRV152 umzugehen. Durch die Bereitstellung der Virus bei einer peripheren Stelle, wie Muskeln, ist es möglich, den Eintritt des Virus in T GrenzEr Gehirn durch eine bestimmte Gruppe von Neuronen. Das resultierende Muster der eGFP-Signal über das gesamte Gehirn löst dann die Nervenzellen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind. Da die verteilte Natur transsynaptische Tracing mit Pseudorabies-Virus macht die Interpretation spezifischen Verbindungen innerhalb eines identifizierten Netzwerk schwierig, präsentieren wir eine empfindliche und zuverlässige Verfahren, bei dem biotinylierte Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) zur Bestätigung der Verbindungen zwischen Zellen identifiziert Verwendung PRV152. Immunochemische Detektion BDA und CTB mit Peroxidase und DAB (3, 3'-Diaminobenzidin) wurde gewählt, weil sie effektiv bei der Aufklärung von zellulären Prozessen, einschließlich distalen Dendriten 6-11.
Introduction
Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn von Nagetieren durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV), vor allem die abgeschwächten Stamm PRV-Bartha erstmals 1961 beschrieben, verwendet 12. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Identifizierung der Motor kortikalen Repräsentation von spezifischen Muskeln oder Muskelgruppen unter Verwendung eines rekombinanten Pseudorabies-Virus-Stamm (PRV152) die verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP) Reporter-Gen 2 zum Ausdruck. Das beschriebene Verfahren nutzt das Verhalten der neurotropen Viren, die infektiösen Nachkommen, dass grenz Synapsen zu anderen Neuronen innerhalb einer Funktionsschaltung 3,4,13 infizieren zu produzieren. PRV152, die isogen mit PRV-Bartha ist, kreuzt nur Synapsen retrograd durch die hierarchische Reihenfolge der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 3,5 </ sup>. Durch präzises Steuern der peripheren Stelle der Infektion ist es möglich, den Eintritt des Virus in das Gehirn durch eine spezifische Untergruppe von Motoneuronen zu begrenzen. Da das Virus infiziert Ketten sequentiell verbundenen Neuronen, wird das sich ergebende Muster eGFP Signal gesamten Gehirn dann lösen das Netzwerk von Neuronen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind.
Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von Virus für neuronale Verfolgung ist die Amplifikation des Reporter-Protein (eGFP in diesem Fall) in infizierten Zellen. Diese Signalverstärkung bietet ein Maß an Sensibilität, die Detektion auch spärlich Projektionen ermöglicht. Zum Beispiel wurde eine spärliche Projektion aus vibrissa motorischen Cortex zu den Gesichtsmotoneuronen Steuern der Whisker in Ratten unter Verwendung viral exprimierten green fluorescent protein 14 gefunden; früheren Studien konnte diesen Vorsprung mit klassischen Tracern ohne Reporter-Gen-Amplifikation 11,15 zu finden. leiderViele virale Verfolgung Vektoren, wie das in der zitierten Studie verwendeten nicht kreuzen Synapsen, wodurch ihre Verwendung für die Rückverfolgung Mehrsynapsenschaltungen einschränkend.
Während der Präsentation deutliche Vorteile für die Identifizierung der Netzwerk von Zellen, die an einem Motorstromkreis, der verteilten Natur transsynaptische Tracing mit PRV-152 macht die Interpretation von spezifischen Verbindungen innerhalb der Schaltung schwierig. Daher präsentieren wir ein einfaches Verfahren für die Validierung von spezifischen Verbindungen innerhalb Schaltungen identifiziert mit PRV-152 durch Doppelklick Etikettierung unter Verwendung von biotinylierten Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB). Der kombinierte Einsatz von BDA und CTB ist ein etablierter Ansatz zur Verfolgung Verbindungen zwischen bestimmten Gruppen von Neuronen 6-8,11. Wenn sie zusammen verwendet werden, können diese beiden Tracer in demselben Abschnitt unter Verwendung eines Zweifarben DAB (3, 3'-Diaminobenzidin) Prozedur 16 visualisiert werden. Hochmolekulare BDA (BDA10kDa) wurde für dieses Protokoll ausgewählt, weil es yields detaillierte Kennzeichnung von neuronalen Prozessen 6,7,9. Zusätzliche Vorteile BDA10kDa gehören die folgenden: Es ist bevorzugt in der anterograde Richtung 6-8 transportiert wird; sie kann durch iontophoretische oder Druckeinspritzung 6-8 geliefert werden; sie kann durch einen einfachen Avidin-biotinyliertem HRP (ABC) Verfahren 17 dargestellt werden; und es kann durch Licht- oder Elektronenmikroskopie 6,7,18 abgebildet werden. Immunchemischen Nachweis von CTb mit Peroxidase und DAB wurde für retrograde Markierung von Motoneuronen gewählt, weil es effektiv bei enthüllt zelluläre Prozesse einschließlich distalen Dendriten 10,19 ist. Vor kurzem haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Stimmkraftwegs in Mäusen zu identifizieren und ein Sparse-Verbindung vom primären Motorkortex den Kehlkopfmotorneurone, was bisher angenommen wurde 20 abwesend sein offenbaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt eine Reihe von Fragen, die berücksichtigt bei der Planung eines Experiments unter Verwendung PRV152 4,21 getroffen werden müssen. Am wichtigsten ist, Pseudorabies-Virus tödlich. Wie zuvor erwähnt, Menschenaffen, einschließlich Menschen, sind nicht anfällig für Infektionen, sondern müssen entsprechende Sorgfalt auf andere Tiere zu schützen. Erwachsene Mäuse überleben in der Regel fünf bis sieben Tage nach der Impfung mit attenuierten PRV152 Belastung. Daher ist PRV152 nicht für Experimente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Toshio Terashima der Universität Kobe, Japan, für die Lehre des Kehlkopfoperationstechnik und Dr. Lynn Enquist von der Princeton University für die Versorgung PRV-Bartha. Forschung wurde von NIH Pioneer Award DP1 OD000448 Erich D. Jarvis und ein NSF Graduate Research Fellowship Award an Gustavo Arriaga unterstützt. Zahlen entsprechend gutgeschrieben früheren Arbeiten werden unter der PLoS ONE offenen Zugang Creative Commons-Lizenz (CC-BY) gemäß redaktionelle Politik der Zeitschrift verwendet.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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