Transsynaptic हैजा विष और biotinylated Dextran एमाइंस डबल लेबलिंग के द्वारा पीछा किया pseudorabies वायरस के साथ परिधीय लक्ष्य से ट्रेसिंग
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsynaptic ट्रेसिंग बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट के माध्यम से परिधीय लक्ष्यों को नियंत्रित करने वाले केंद्रीय efferents का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है। यह तरीका सबसे बड़े पैमाने पर स्वाइन रोगज़नक़ pseudorabies वायरस (इनका उपयोग) 1 का उपयोग करके मस्तिष्क में इस्तेमाल किया गया है। इनका उपयोग मानव सहित महान वानर, संक्रमित नहीं करता है, तो यह सबसे अधिक छोटे स्तनपायी, विशेष रूप से कृन्तकों पर अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। pseudorabies तनाव PRV152 बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) रिपोर्टर जीन व्यक्त किया और केवल प्रतिगमनपूर्वक दूर संक्रमण साइट 2,3 से synaptic कनेक्शन की श्रेणीबद्ध दृश्य के माध्यम से कार्यात्मक synapses पार करती है। अन्य इनका उपभेदों अलग सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुण होते हैं और दोनों दिशाओं (इनका उपयोग-बेकर और इनका उपयोग-कापलान) 4,5 में ले जाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल PRV152 साथ विशेष रूप से सौदा होगा। ऐसे मांसपेशियों के रूप में, एक परिधीय स्थल पर वायरस देने से, यह टी में वायरस के प्रवेश को सीमित करने के लिए संभव हैन्यूरॉन्स की एक विशिष्ट सेट के माध्यम से वह मस्तिष्क। मस्तिष्क भर EGFP संकेत के परिणामस्वरूप पैटर्न तो शुरू में संक्रमित कोशिकाओं से जुड़े हैं कि न्यूरॉन्स हल करता है। Pseudorabies वायरस से transsynaptic ट्रेसिंग के वितरित प्रकृति मुश्किल एक पहचान नेटवर्क के भीतर विशिष्ट कनेक्शन की व्याख्या करता है, हम प्रयोग कर पहचान की कोशिकाओं के बीच कनेक्शन की पुष्टि के लिए biotinylated dextran अमाइन (बीडीए) और हैजा विष सबयूनिट बी (ब्यूरो) रोजगार एक संवेदनशील और विश्वसनीय तरीका मौजूद है PRV152। वे बाहर का डेन्ड्राइट 6-11 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं का खुलासा करने में प्रभावी रहे हैं, क्योंकि peroxidase और थपका (3, 3'-diaminobenzidine) के साथ बीडीए और CTB की immunochemical का पता लगाने के लिए चुना गया था।
Introduction
Transsynaptic ट्रेसिंग बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट के माध्यम से परिधीय लक्ष्यों को नियंत्रित करने वाले केंद्रीय efferents का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है। यह तरीका सबसे बड़े पैमाने पर विशेष रूप से तनु तनाव इनका-Bartha पहले 1961 में वर्णित स्वाइन रोगज़नक़ pseudorabies वायरस (इनका उपयोग), के उपयोग से कृंतक मस्तिष्क में इस्तेमाल किया गया है 12। यहाँ, हम विशिष्ट मांसपेशियों की मोटर cortical प्रतिनिधित्व की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत या बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) पत्रकार जीन 2 व्यक्त एक पुनः संयोजक pseudorabies वायरस तनाव (PRV152) का उपयोग मांसपेशी समूहों। वर्णित विधि पार synapses के एक कार्यात्मक सर्किट 3,4,13 के भीतर अन्य न्यूरॉन्स को संक्रमित करने के लिए है कि संक्रामक संतान का उत्पादन जो neurotropic वायरस, के व्यवहार का लाभ उठाते। इनका उपयोग-Bartha साथ isogenic है जो PRV152, केवल दूर संक्रमण साइट 3,5 <से प्रतिगमनपूर्वक synaptic कनेक्शन की श्रेणीबद्ध दृश्य के माध्यम से synapses के पार/ Sup>। ठीक संक्रमण के परिधीय साइट को नियंत्रित करके यह मोटर न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट सबसेट के माध्यम से मस्तिष्क में वायरस के प्रवेश को सीमित करने के लिए संभव है। वायरस क्रमिक रूप से जुड़ा हुआ न्यूरॉन्स की जंजीरों को संक्रमित करता है के रूप में, मस्तिष्क भर EGFP संकेत के परिणामस्वरूप पैटर्न तो शुरू में संक्रमित कोशिकाओं से जुड़े हैं कि न्यूरॉन्स के नेटवर्क को हल करेंगे।
तंत्रिका पता लगाने के लिए वायरस का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ यह संक्रमित कोशिकाओं के भीतर संवाददाता प्रोटीन (इस मामले में EGFP) के प्रवर्धन है। यह संकेत प्रवर्धन भी विरल अनुमानों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है कि संवेदनशीलता का एक स्तर प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, मूंछ को नियंत्रित करने के चेहरे की मोटर न्यूरॉन्स के लिए vibrissa मोटर प्रांतस्था से एक विरल प्रक्षेपण virally व्यक्त हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 14 का उपयोग चूहों में पाया गया था; पिछले अध्ययनों पत्रकार जीन प्रवर्धन 11,15 बिना शास्त्रीय ट्रेसर उपयोग करते हुए इस प्रक्षेपण खोजने में असफल रहा। दुर्भाग्य से, कई वायरल ट्रेसिंग वैक्टर, उद्धृत अध्ययन में इस्तेमाल एक तरह, जिससे बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट पता लगाने के लिए उनके उपयोग को सीमित करने, synapses के पार नहीं करते।
एक मोटर सर्किट में भाग लेने की कोशिकाओं के नेटवर्क की पहचान के लिए विशेष लाभ प्रस्तुत करते हुए transsynaptic की वितरित प्रकृति इनका उपयोग -152 मुश्किल सर्किट के भीतर विशिष्ट कनेक्शन की व्याख्या करता है के साथ अनुरेखण। इसलिए, हम biotinylated dextran अमाइन (बीडीए) और हैजा विष सबयूनिट बी (ब्यूरो) का उपयोग डबल लेबलिंग द्वारा इनका उपयोग -152 का उपयोग पहचान सर्किट के भीतर विशिष्ट कनेक्शन मान्य करने के लिए एक सरल तरीका मौजूद है। बीडीए और CTB के संयुक्त उपयोग न्यूरॉन्स 6-8,11 के विशिष्ट सेट के बीच कनेक्शन पता लगाने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण है। जब एक साथ थे, इन दोनों ट्रेसर एक दो रंग थपका (3, 3'-diaminobenzidine) प्रक्रिया 16 का उपयोग एक ही अनुभाग में देखे जा सकते हैं। उच्च आणविक भार बीडीए (BDA10kDa) इस प्रोटोकॉल के लिए चयनित किया गया था यह y क्योंकिneuronal प्रक्रियाओं 6,7,9 की विस्तृत लेबलिंग ields। BDA10kDa का अतिरिक्त लाभ निम्नलिखित शामिल हैं: यह रियायत के अग्रगामी दिशा 6-8 में ले जाया जाता है; यह iontophoretic या दबाव इंजेक्शन 6-8 से दिया जा सकता है; यह एक साधारण avidin-biotinylated एचआरपी (एबीसी) प्रक्रिया 17 से देखे जा सकते हैं; और यह प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 6,7,18 से ली जा सकती है। यह बाहर का डेन्ड्राइट 10,19 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं का खुलासा करने में प्रभावी है क्योंकि peroxidase और थपका साथ CTB की immunochemical पता लगाने motoneurons की प्रतिगामी लेबलिंग के लिए चुना गया था। हमने हाल ही में चूहों में मुखर मोटर मार्ग की पहचान करने के लिए और पहले से 20 अनुपस्थित होना मान लिया गया था, जो स्वरयंत्रज मोटर न्यूरॉन्स को प्राथमिक मोटर प्रांतस्था से एक विरल कनेक्शन प्रकट करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
PRV152 4,21 का उपयोग कर एक प्रयोग की योजना बनाते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि मुद्दों के एक नंबर रहे हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, pseudorabies वायरस घातक है। जैसा कि पहले उल्लेख, मानव सहित महान वानर, संक्रमण के लिए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम स्वरयंत्रज सर्जरी तकनीक सिखाने के लिए, कोबे विश्वविद्यालय, जापान के डॉ तोशियो Terashima धन्यवाद, और इनका उपयोग-Bartha की आपूर्ति के लिए प्रिंसटन विश्वविद्यालय के डॉ लिन Enquist। अनुसंधान एरिक डी जार्विस एनआईएच अग्रणी पुरस्कार DP1 OD000448 और गुस्तावो Arriaga के लिए एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया। उचित रूप से श्रेय पिछले काम से आंकड़े जर्नल के संपादकीय नीतियों के अनुसार एक PLoS ओपन एक्सेस क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस (सीसी से) के तहत किया जाता है।
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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