コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）1を利用して脳内で使用されています。 PRVは、ヒトを含む大型類人猿を、感染していないので、それは、最も一般的に小型哺乳類、特にげっ歯類での研究で使用されています。仮性狂犬病株PRV152は、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子を発現し、逆行だけ離れた感染部位から2,3シナプス結合の階層的なシーケンスを機能的シナプスを横切ります。他のPRV株は、異なる微生物学的特性を有し、両方向（PRV-ベッカーとPRV-カプラン）4,5に搬送することができます。このプロトコルは、PRV152を独占的に扱います。筋肉のような末梢部位にウイルスを送達することによって、それがTへのウイルスの侵入を制限することが可能です神経細胞の特定のセットを通じ、彼は脳。脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンを解決します。仮性狂犬病ウイルスを使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な識別されたネットワーク内の特定の接続を解釈させるように、私たちは使用して識別されたセル間の接続を確認するために、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用する高感度かつ信頼性の高い方法を提示PRV152。彼らは、遠位樹状突起6-11を含む細胞プロセスを明らかにするのに効果的であるため、ペルオキシダーゼおよびDAB（3、3'-ジアミノベンジジン）とBDAとCTbをの免疫化学的検出を選択しました。
Introduction
経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）、PRV-バーサは、最初1961 12に記載とりわけ弱毒株を利用して、げっ歯類の脳に使用されている。ここでは、特定の筋肉の運動皮質の表現を識別するためのプロトコルを提示強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子2を発現する組換え仮性狂犬病ウイルス株（PRV152）を使用して、または筋肉群。記載されている方法は、クロスシナプスが機能回路3,4,13内の他のニューロンに感染することは感染性の子孫を生み出す神経向性ウイルスの挙動を利用しています。 PRV-バーサと同質遺伝子であるPRV152は、唯一の<離れ感染部位3,5からのシナプス結合の階層的なシーケンスを逆行性シナプスを横切ります/ SUP>。正確感染末梢部位を制御することにより、運動ニューロンの特定のサブセットを介して脳へのウイルスの侵入を制限することができます。ウイルス順次接続されているニューロンのチェーンに感染したように、脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンのネットワークを解決します。
ニューラルトレースのウイルスを使用することのさらなる利点は、感染細胞内のレポータータンパク質（この場合はEGFP）の増幅です。この信号増幅も疎突起の検出を可能にする感度のレベルを提供します。例えば、ウィスカーを制御顔面運動ニューロンへの感覚毛の運動野からのスパース投影がウイルス発現緑色蛍光タンパク質14を用いて、ラットで発見されました。以前の研究は、レポーター遺伝子増幅11,15なしで古典的なトレーサーを使用して、この投影法を見つけることができませんでした。残念ながら、多くのウイルスベクターがトレース挙げ研究で使用したものと同様に、それによって多シナプス回路をトレースするためのそれらの使用を制限し、シナプスを横断しません。
モータ回路に参加した細胞のネットワークを識別するための明確な利点を提示しながら、PRV-152を使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な回路内の特定の接続を解釈することができます。したがって、我々は、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用して、二重標識によってPRV-152を使用して識別回路内の特定の接続を検証するための簡単な方法を提示します。 BDAとCTbをの併用は、ニューロン6-8,11の特定のセットの間の接続をトレースするための十分に確立された手法です。一緒に使用する場合、これらの二つのトレーサーは、2色DAB（3、3'-ジアミノベンジジン）手順16を使用して同じ部分に可視化することができます。高分子量BDA（BDA10kDaは）それYので、このプロトコルを選択しました神経プロセス6,7,9の詳細なラベル付けをields。 BDA10kDaのさらなる利点は、以下のものがあります。それは、優先的に順行方向6-8に搬送されます。それは、イオン導入や圧力注入6-8で配信することができます。それは、単純なアビジン-ビオチン化HRP（ABC）の手順17で視覚化することができます。それは、光または電子顕微鏡6,7,18によって画像化することができます。それは、遠位樹状突起10,19を含む細胞プロセスを明らかにするのに有効であるため、ペルオキシダーゼおよびDABとCTbをの免疫化学的検出は、運動ニューロンの逆行性標識のために選ばれました。我々は最近、マウスでのボーカル運動経路を特定するために、以前に20存在しないと仮定した喉頭運動ニューロンへの一次運動野から疎な接続を明らかにするために、このアプローチを使用していました。
Protocol
Representative Results
Discussion
PRV152 4,21を用いた実験を計画する際に考慮に入れなければならない多くの問題があります。最も重要なのは、仮性狂犬病ウイルスは致命的です。前述したように、ヒトを含む大型類人猿は、感染に対して感受性ではなく、適切なケアは、他の動物を保護するために行使されなければなりません。成体マウスは通常、5〜7日間の弱毒PRV152株を接種した後に生き残ります。したがって…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、喉頭手術技術を教えるため、神戸大学、日本の博士俊夫寺島に感謝し、PRV-バーサを供給するためのプリンストン大学のDr.リンEnquist。研究は、エーリッヒ・D・ジャービスとグスタボ・アリアガにNSF大学院研究フェローシップ賞にNIHのパイオニア賞DP1 OD000448によってサポートされていました。適切に入金前作からフィギュアは、ジャーナルの編集方針に従ってPLoSのONEオープンアクセスクリエイティブ・コモンズ・ライセンス（CC-BY）の下で使用されています。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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