Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 접근법은 가장 광범위 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV) (1)을 이용하여 뇌에 사용되어왔다. PRV는 인간을 비롯한 영장류를 감염시키지 않으므로 가장 일반적으로 작은 포유류, 특히 설치류 연구에 사용된다. (僞) 균주 PRV152는 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 리포터 유전자를 발현하고 만 역행 떨어져 감염 부위에서 2,3- 시냅스 연결의 계층 순서를 기능적 시냅스 십자가. 기타 PRV 균주는 별개의 미생물 학적 특성을 가지고 두 방향 (PRV-베커와 PRV-카플란) 4,5에서 전송 될 수있다. 이 프로토콜은 PRV152 독점적으로 다룰 것이다. 근육과 같은 말초 부위에서 바이러스를 제공함으로써, t로 바이러스의 침입을 제한 할 수있다뉴런의 특정한 세트를 통해 그 뇌. eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 연결된 뉴런을 해결. (僞) 바이러스와 transsynaptic 추적의 분산 특성이 어려운 식별 된 네트워크 내에서 특정 연결을 해석한다, 우리는 사용하여 식별 세포 사이의 연결을 확인하기위한 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 서브 유닛 B (CTB)를 사용하는 민감하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다 PRV152. 그들은 말초 돌기 6-11 포함한 세포 과정을 계시하는데 효과적이기 때문에 옥시다아제 및 DAB (3,3'- 디아 미노)와 BDA 및 CTB의 면역 검출을 선택 하였다.
Introduction
Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 방법은 가장 광범위 특히 약독 화 균주 PRV-Bartha은 1961에서 설명 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV)을 이용하여 쥐의 뇌에서 사용되어왔다 (12). 여기서는 특정 근육의 운동 피질 표현을 식별하기위한 프로토콜을 제시 또는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 2 리포터 유전자 발현 (僞) 재조합 바이러스 균주 (PRV152)를 사용하여 근육 그룹. 한 방법은 간 시냅스가 기능 회로 3,4,13 내의 다른 신경 세포를 감염시킬 것을 전염성 자손을 생산 neurotropic 바이러스의 동작을 이용한다. PRV-Bartha과 동종이다 PRV152은 단지 거리에 감염 사이트 3,5 <에서 역행 시냅스 연결의 계층 순서를 통해 시냅스를 교차/ SUP>. 정확하게 감염의 외주 위치를 제어함으로써, 그 운동 뉴런의 특정 서브 세트를 통해 뇌에 바이러스의 침입을 제한 할 수있다. 바이러스 순차적으로 연결된 뉴런의 체인을 감염 같이, eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 접속되어 신경 네트워크를 해결할 것이다.
신경 추적하는 바이러스를 사용하는 부가적인 이점은 감염된 세포 내에서 리포터 단백질 (이 경우 eGFP는)의 증폭이다. 이 신호 증폭에도 희소 돌기의 검출 감도의 허용 레벨을 제공한다. 예를 들면, 수염을 제어 안면 운동 뉴런에 vibrissa 모터 피질에서 희소 돌기 급속도로 표현 녹색 형광 단백질 (14)을 사용하여 래트에서 발견되었다; 이전의 연구는 리포터 유전자 증폭 11, 15 않고 고전 추적기를 사용하여이 투사를 찾지 못했습니다. 불행하게도많은 바이러스 추적 벡터는, 인용 된 연구에서 사용 된 것과 같은, 다중함으로써 시냅스 회로 추적을위한 이들의 사용을 제한하는, 시냅스 교차하지 않는다.
모터 회로에 참여하는 세포의 네트워크를 식별하기위한 고유 한 장점을 제시하고 있지만, transsynaptic의 분산 특성은 PRV-152 곤란 회로 내의 특정 연결을 해석하게하여 추적. 따라서, 우리는 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 사용하여 이중 라벨에 의해 PRV-152을 사용하여 식별 회로 내의 특정 연결을 검증하기위한 간단한 방법을 제시한다. BDA와 CTB의 병용은 신경 6-8,11의 특정 세트 사이의 연결을 추적하는 잘 확립 된 방법입니다. 함께 사용되는 경우, 이들 두 추적자 2 색 DAB (3,3'- 디아 미노) 프로 시저 (16)를 사용하여 동일한 구역으로 시각화 될 수있다. 고 분자량 BDA (BDA10kDa)은이 프로토콜을 선택한 것이 Y 때문에신경 과정 6, 7의 상세한 라벨을 ields. BDA10kDa의 추가 장점은 다음과 같습니다 :이 우선적으로 선행 성 방향 6-8로 운송된다; 이는 이온 삼투압 또는 압입 6-8에 의해 전달 될 수있다; 그것은 단순한 아비딘 – 바이오틴 HRP (ABC) 프로 시저 (17)에 의해 시각화 될 수있다; 그것은 빛 또는 전자 현미경 6,7,18에 의해 촬영 할 수 있습니다. 이 원위 수상 돌기 10,19 포함 세포 과정을 공개 효과적이기 때문에 퍼 옥시 다제 및 DAB와 CTB의 면역 화학적 검출의 motoneurons의 역행 라벨 선택되었다. 우리는 최근 생쥐의 보컬 모터 경로를 확인하고 이전에 20 부재로 가정 된 후두 운동 신경, 1 차 운동 피질에서 스파 스 연결을 나타 내기 위해이 방법을 사용했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PRV152 4,21 이용한 실험을 계획 할 때 고려되어야 문제들이있다. 가장 중요한 것은, (僞) 바이러스는 치명적이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 인간을 비롯한 영장류가 감염에 민감하지 않지만 적절한주의가 다른 동물을 보호하기를 기울여야한다. 성인 마우스는 일반적으로 5-7일 감쇠 PRV152 균주 접종 후 생존. 따라서, PRV152 1 주일 이상 생존 시간을 필요로 실험에 적합하지 않습니다. 또한, 감염?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 후두 수술 기술을 가르치는, 고베 대학, 일본의 박사 토시오 테라지마 감사와 PRV-Bartha를 공급하는 프린스턴 대학의 박사 린 Enquist. 연구는 에리히 D. 자비스에 NIH 개척자 상 DP1 OD000448와 구스타보 Arriaga에 NSF 대학원 연구 활동 상에 의해 지원되었다. 적절하게 적립 이전의 연구에서 수치 저널의 편집 정책에 따라 PLoS의 하나 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 라이선스 (CC-BY)에서 사용된다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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