Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Transsynaptisk spårning har blivit ett kraftfullt verktyg som används för att analysera centrala efferents som reglerar perifera mål genom flera synaptiska kretsar. Detta tillvägagångssätt har mest använda i hjärnan genom att utnyttja svinpatogenen pseudorabiesvirus (PRV) 1. PRV smittar inte människoapor, inklusive människor, så det är vanligast i studier på små däggdjur, särskilt gnagare. Den pseudorabiesstam PRV152 uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) reportergen och endast korsar funktionella synapser retrograd genom den hierarkiska sekvensen av synapsförbindelser bort från infektionsstället 2,3. Andra PRV stammar har tydliga mikrobiologiska egenskaper och kan transporteras i båda riktningarna (PRV-Becker och PRV-Kaplan) 4,5. Detta protokoll kommer att enbart behandla PRV152. Genom att leverera viruset vid en perifer plats, såsom muskel, är det möjligt att begränsa inträde av viruset i Than hjärnan genom en specifik uppsättning nervceller. Det resulterande mönstret av EGFP-signalen i hela hjärnan löser därefter de neuroner som är anslutna till de initialt infekterade celler. Som den distribuerade karaktär transsynaptisk spårning med pseudorabiesvirus gör att tolka vissa anslutningar inom en identifierad nätverk svårt, presenterar vi en känslig och tillförlitlig metod som använder biotinylerade dextran aminer (BDA) och koleratoxin subenhet B (CTB) för att bekräfta sambandet mellan celler som identifieras med hjälp av PRV152. Immunokemisk detektion av BDA och CTB med peroxidas och DAB (3, 3'-diaminobensidin) valdes därför att de är effektiva på att avslöja cellulära processer inklusive distala dendriter 6-11.
Transsynaptisk spårning har blivit ett kraftfullt verktyg som används för att analysera centrala efferents som reglerar perifera mål genom flera synaptiska kretsar. Detta tillvägagångssätt har mest flitigt i gnagare hjärnan genom att utnyttja svin patogen pseudorabiesvirus (PRV), särskilt den försvagade stammen PRV-Bartha först beskrevs 1961 12. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera motor kortikala representation av specifika muskler eller muskelgrupper med användning av en rekombinant pseudorabiesvirusstam (PRV152) som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) reportergen 2. Den beskrivna metoden utnyttjar beteende neurotropa virus, som producerar infektiös avkomma som tvär synapser att infektera andra nervceller i en funktionell krets 3,4,13. PRV152, vilket är isogen med PRV-Bartha, korsar bara synapser retrograd genom den hierarkiska sekvens av synapsförbindelser bort från infektionsstället 3,5 </ sup>. Genom att exakt kontrollera den perifera infektionsstället är det möjligt att begränsa inträde av viruset in i hjärnan genom en särskild undergrupp av motomeuroner. Eftersom viruset sekventiellt infekterar kedjor av anslutna nervceller, kommer det resulterande mönstret av EGFP-signalen i hela hjärnan sedan lösa det nätverk av neuroner som är anslutna till de initialt infekterade celler.
En ytterligare fördel med att använda viruset för neural spårning är amplifieringen av reporterproteinet (EGFP i detta fall) i infekterade celler. Denna signal förstärkning ger en nivå av känslighet som tillåter detektion av även glesa utsprång. Till exempel var en gles utsprång från vibrissa motoriska cortex till ansikts motoriska nervceller som styr hårkristaller hittades på råttor med användning viralt uttryckt grönfluorescerande protein 14; tidigare studier misslyckats med att hitta denna projektion med hjälp av klassiska spårämnen utan reportergen förstärkning 11,15. Tyvärr, Många virala spårning vektorer, som den som används i den citerade studien, korsa inte synapser, vilket begränsar deras användning för att spåra fler synaptiska kretsar.
Medan presentera tydliga fördelar för att identifiera nätverket av celler som deltar i en motorkrets, distribuerade karaktär transsynaptisk spårning med PRV-152 gör att tolka vissa anslutningar inom kretsen svårt. Därför presenterar vi en enkel metod för att validera specifika anslutningar inom kretsar identifieras med hjälp av PRV-152 genom att dubbelmärkning med hjälp av biotinylerade dextran aminer (BDA) och koleratoxin subenhet B (CTB). Den kombinerade användningen av BDA och CTB är en väletablerad metod för att spåra kopplingar mellan specifika typer av nervceller 6-8,11. När de används tillsammans, kan dessa två spår visualiseras i samma avsnitt med hjälp av en tvåfärgad DAB (3, 3 'diaminobensidin) förfarandet 16. Högmolekylärt BDA (BDA10kDa) valdes för detta protokoll eftersom det yields detaljerad märkning av neuronala processer 6,7,9. Ytterligare fördelar med BDA10kDa innefattar följande: det är företrädesvis transporteras i antero riktningen 6-8; det kan levereras av jontoforetiskt eller tryck injektion 6-8; det kan visualiseras genom en enkel avidin-biotinylerat HRP (ABC) förfarande 17; och den kan förses med bild genom ljus- eller elektronmikroskopi 6,7,18. Immunokemisk detektion av CTB med peroxidas och DAB valdes för retrograd märkning av motoneuroner eftersom det är effektivt vid avslöjande cellulära processer inklusive distala dendriter 10,19. Vi använde nyligen denna metod för att identifiera röstmotorvägen hos möss och att avslöja en gles anslutning från primära motoriska cortex till laryngeala motoriska nervceller, som tidigare antogs vara frånvarande 20.
Det finns ett antal frågor som måste beaktas när man planerar ett experiment med PRV152 4,21. Viktigast är pseudorabiesvirus dödlig. Som tidigare nämnts, stora apor, inklusive människor är inte mottagliga för smitta, men lämplig vård måste iakttas för att skydda andra djur. Vuxna möss överlever vanligtvis fem till sju dagar efter ympning med den försvagade PRV152 stammen. Därför är PRV152 inte lämpligt för experiment som kräver överlevnadstider längre än en vecka. Dessutom infekterade…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Toshio Terashima i Kobe University, Japan, för att lära av laryngeal kirurgi teknik, och Dr. Lynn Enquist av Princeton University för att leverera PRV-Bartha. Forskningen stöddes av NIH pionjär utmärkelse DP1 OD000448 till Erich D. Jarvis och en NSF Graduate Research Fellowship utmärkelse till Gustavo Arriaga. Siffror från lämpligt kredit tidigare arbete används under PLoS ONE open access Creative Commons-licens (CC-BY) i enlighet med tidskriftens redaktionella politik.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
[header] | |||
VetBond | 3M | 1469SB | |
Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |