Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV) 1 kullanılarak beyinde kullanılmaktadır. PRV insanlar dahil olmak üzere büyük maymunları enfekte etmez, bu yüzden en yaygın küçük memeliler, özellikle kemirgenler üzerinde çalışmalarda kullanılmaktadır. Pseudorabies zorlanma PRV152 gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) raportör geni ifade ve sadece retrograd uzak enfeksiyon sitesinden 2,3 sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi ile fonksiyonel sinapsların geçer. Diğer PRV suşları farklı mikrobiyolojik özelliklere sahip ve her iki yönde (PRV-Becker ve PRV-Kaplan) 4,5 'de taşınabilir. Bu protokol PRV152 münhasıran ele alacağız. Böyle kas gibi, periferik yerinde virüsü teslim ederek, t içine virüsün girişini sınırlamak mümkündürnöronların belirli bir set üzerinden beyni. Beyin boyunca eGFP sinyalinin elde edilen şablon, bu durumda başlangıçta enfekte olan hücrelere bağlı nöronların giderir. Pseudorabies virüs transsinaptik izleme dağıtık yapısı zor bir tanımlanmış bir ağ içinde belirli bağlantı yorumlama yapar, biz kullanılarak tespit hücreleri arasındaki bağlantıları teyit için biyotinli dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak hassas ve güvenilir bir yöntem sunmak PRV152. Onlar uzak dendritler 6-11 olmak üzere hücresel süreçleri ortaya etkilidir çünkü peroksidaz ve DAB (3, 3'-diaminobenzidin) ile BDA ve CTB immunokimyasal tespiti seçildi.
Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın, özellikle zayıflatılmış suş PRV-Bartha ilk kez 1961 yılında açıklanan domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV), kullanılarak kemirgen beyinde kullanılmaktadır 12. Burada, belirli kasların motor kortikal temsilini belirlemek için bir protokol mevcut veya gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) raportör geninin 2 eksprese eden bir rekombinant pseudorabies virüs suşu (PRV152) ile kas grupları. Açıklanan yöntem çapraz sinaps fonksiyonel devre 3,4,13 içindeki diğer nöronlar bulaştırmak için bu bulaşıcı döl üreten nörotropik virüsler, davranışını patlatır. PRV-Bartha ile izojenik olan PRV152, sadece uzak enfeksiyon sitesinden 3,5 <dan retrograd sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi boyunca sinaps haçlar/ sup>. Tam olarak enfeksiyonun periferal sitesi kontrol edilmesiyle motor nöronların spesifik bir alt kümesi üzerinden beyne virüs girişini sınırlamak mümkündür. Virüs sırayla bağlı nöronların zincirlerini bozar gibi, beynin boyunca eGFP sinyalinin ortaya çıkan desen sonra başlangıçta enfekte hücrelere bağlı olan nöronların ağı çözecektir.
Nöral izleme için virüs kullanılarak bir başka avantajı, enfekte olmuş hücreler içinde raportör proteininin (bu durumda EGFP) amplifikasyonu olup. Bu sinyal amplifikasyon bile seyrek projeksiyonlar algılanmasını sağlar duyarlılık düzeyi sağlar. Örneğin, bıyık kontrol yüz motor nöronlara bıyık motor korteks bir seyrek projeksiyon viral ifade yeşil flüoresan protein 14 ile sıçanlarda bulundu; önceki çalışmalar raportör gen amplifikasyonu 11,15 olmadan klasik izleyiciler kullanarak bu projeksiyonu bulamadılar. Ne yazık kiBirçok viral izleme vektörleri belirtilen çalışmada kullanılan gibi, bu şekilde, çok-sinaptik devreleri izlemek için kullanımlarını sınırlamaktadır sinaps geçmez.
Motor devresinde katılan hücrelerin ağını tanımlamak için farklı avantajlar sunarken, transsinaptik dağıtık yapısı PRV-152 zorlu devre içinde belirli bağlantıları yorumlama yapar ile izleme. Bu nedenle, biz biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak çift etiketleme PRV-152 kullanılarak tespit devreler içinde belirli bağlantıları doğrulamak için basit bir yöntem mevcut. BDA ve CTB kombine kullanımının nöronlar 6-8,11 özel setler arasındaki bağlantıları izlemek için köklü bir yaklaşımdır. Birlikte kullanıldığında, bu iki izleyiciler iki renkli DAB (3, 3'-diaminobenzidin) prosedürü 16 kullanarak aynı bölümünde görülebilir. Yüksek molekül ağırlıklı BDA (BDA10kDa) bu protokol için seçildi bu y çünkünöron 6,7,9 ayrıntılı etiketleme ields. BDA10kDa diğer avantajları arasında aşağıdakiler bulunmaktadır: bu tercihan anterograd yönünde 6-8 taşınır; o iyontoforetik veya basınçlı enjeksiyon 6-8 teslim edilebilir; basit bir avidin biotinillenmemiş HRP (ABC) prosedürü 17 tarafından görüntülenmiştir olabilir; ve ışık veya elektron mikroskobu 6,7,18 tarafından görüntülenebilir. Distal dendritler 10,19 gibi hücresel süreçleri ortaya çıkartılmasında etkili olduğu için peroksidaz ve DAB ile CTB immünokimyasal algılama motor nöronlar retrograd etiketlenmesi için seçildi. Biz son zamanlarda farelerde vokal motorlu yolu belirlemek ve daha önce 20 eksik olarak kabul edildi laringeal motor nöronların, primer motor korteks gelen seyrek bir bağlantı ortaya çıkarmak için bu yaklaşımı kullanılır.
PRV152 4,21 kullanarak bir deney planlanırken dikkate alınması gereken konulardan bir dizi vardır. Daha da önemlisi, pseudorabies virüs öldürücü. Daha önce belirtildiği gibi, insanlar da dahil olmak üzere büyük maymunlar, enfeksiyona duyarlı değildir, ancak uygun bakım diğer hayvanları korumak için dikkatli olunmalıdır. Yetişkin farelerde tipik haliyle beş ila yedi gün, zayıflatılmış PRV152 suşu ile aşılamadan sonra hayatta. Bu nedenle, PRV152 bir haftadan daha uzun bir hayatt…
The authors have nothing to disclose.
Biz laringeal cerrahi tekniği öğretmek için, Kobe Üniversitesi, Japonya Dr. Toshio Terashima teşekkür ve PRV-Bartha temini için Princeton Üniversitesi'nden Dr. Lynn Enquist. Araştırma Erich Jarvis D. NIH öncü ödülü DP1 OD000448 ve Gustavo Arriaga bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu ödülü ile desteklenmiştir. Uygun kredili önceki çalışmalarından Rakamlar derginin editoryal politikalarına uygun PLoS ONE açık erişim Creative Commons lisansı (CC-BY) altında kullanılmaktadır.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
[header] | |||
VetBond | 3M | 1469SB | |
Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |