Summary
この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。
Abstract
哺乳動物の赤血球生成は、赤血球の形成をもたらす摘出の劇的プロセスを終了します。摘出のメカニズムはまだ完全には解明されていない。顕微鏡による除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在を研究する際に遭遇する一般的な問題は、摘出を受けている細胞の十分な数を観察することが困難なことである。我々は、フロー内のマルチパラメータの高速セルイメージング（マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー）を効率的に除核事象のかなりの数を識別するために、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法を組み合わせた方法を用いて新規な分析プロトコルを開発し、それはを可能にする測定値を取得し、統計解析を行う。
まず、ここでは、マウス赤芽球を同期し、目に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される2つのin vitro赤血球新生培養法を記載評価のE時間。次に、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。サイズおよびオルソ赤芽球を識別するために使用されDNA/Ter119染色と共に、我々は、細長い細胞の認識および「デルタ重心XY Ter119/Draq5に役立つ明視野チャンネル内のセルのパラメータ「アスペクト比」を利用"それはTER119染色（新生網赤血球）の中心は、このように脱核するのに約セルを示す、遠く離れDRAQ5染色（押出を受けて核）の中心からである細胞事象の同定を可能にする。高いデルタ重心と低アスペクト比を有するオルソ赤芽球集団のサブセットは高度に細胞を除核内に濃縮される。
Introduction
哺乳動物の赤血球系統内の端末分化はオルソ赤芽球は赤血球2を生成し 、その膜包ま核（pyrenocyte）1を排出を通して摘出の劇的過程でまとめられる。また、インビトロで赤血球の成功した、大規模生産の律速段階であるこのプロセスの正確なメカニズムは、まだ完全には解明されていない。除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在は、蛍光および電子顕微鏡3-5の使用に依存している。この面倒なプロセスは、一般的に摘出イベントの限られた数の識別をもたらし、常に意味のある統計的な分析を可能にしていません。マクグラスら 6により、前述の赤芽球の識別方法に拡大し、我々は、マルチスペクトルいまで摘出イベントを特定し、研究する新しいアプローチを開発した測定値を取得し、統計分析を実行するために十分な数の観測値を提供することができるエージングフローサイトメトリー（フローにおける多パラメータの高速セルイメージング、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を組み合わせた方法）7。
ここでは、赤芽球を同期し、評価時に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される最初の2つのin vitroでの赤血球形成培養法を記載している。その後、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。
サンプルは、フローサイトメーターイメージングフロー上で実行され、回収した細胞をオルソ赤芽球6を識別するために、適切にゲートされています。明いまで測定されるオルソ赤芽球は、次いで、それらのアスペクト比に基づいて分析されそれぞれTER119及びDNAのために染色された領域の中心間の距離として定義されるパラメータデルタ重心XY TER119-DNA、のためのそれらの値に対するエージング。低アスペクト比及び高いデルタ重心XY Ter119/DNAを有する細胞の集団は、高度に細胞を除核内に濃縮される。 - / -たRac2上のRac1のMX-Creを媒介条件の削除と赤芽球に対する野生型（WT）赤芽球を使用して、または組み合わせたRac2 - / - ; RAC3 - / -遺伝的背景およびマルチスペクトル画像のこの新規な分析プロトコルは、フローサイトメトリー、我々は最近、脱核が非対称分裂に似ているし、RACのGTPaseによって部分的に調節アクトミオシン環の形成が摘出進行7のために重要であるとことを明らかにした。
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Protocol
体外赤血球文化の中で 1。長期（ex vivoで赤血球分化培養プロトコルGiarratanaによるら 8、修正およびマウス細胞に適応）
これは、in vitro赤血球生成プロトコルで 3段階の長期的である。最初のステップ（0〜4日目）は、2×10 5細胞/ mlを、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン-3（IL-3）、エリスロポエチン（EPO）を補充した赤芽球増殖培地中に置かれる。第二工程（5-6日間）において、細胞は、Epoを用いてのみ補充した新鮮赤芽球の増殖培地中で接着性間質細胞上/ mlで共培養し、2×10 5細胞（MS5）に再懸濁する。第三段階（7-9日間）において、細胞は、最大除核のサイトカイン（ 図1A）なしの新鮮な赤芽球の増殖培地中のMS-5細胞の層上で培養される。
全ての動物プロトコルはの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたシンシナティ小児病院医療センター。
- 骨および低密度骨髄細胞の単離の収穫
- 2ミリリットルを15 mlのコニカルチューブ中の2％ウシ胎児血清（FBS）を含有する滅菌IMDMを追加し、氷上に保つ。
- 機関が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入、）は、次の（興味のある遺伝的に標的とするマウスの有無にかかわらず一緒に）2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを安楽死させる。
- 、鉗子やメスを用いて骨盤骨、大腿骨、および両足の脛骨を分離IMDM +2％FBSを含むチューブに追加し、氷上に保つ。
- 1ミリリットルピンセットを用いて、滅菌フローサイトメトリーチューブとフラッシュ骨にIMDM +2％FBSおよび25-G×5/8 "針でツベルクリン注射器を追加します。フラッシュIMDM +2％FBS、骨を通して数回静かに（ ）を細胞懸濁液から〜500μLを吸引し、骨を再度フラッシングすることにより、およびフローcytometrに骨髄細胞を採取Yチューブ。骨が白くなったフラッシングは完了です。
- 50 mlのコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーセットを介して細胞懸濁液をフィルタリングする。 IMDM +2％のFBSと同じ培地を5mlの細胞懸濁液の最終体積を調節用いてセルストレーナーを洗浄する。
- 密度勾配遠心分離により、低密度骨髄細胞（LDBM）を準備し、慎重に25 750×gで15 mlチューブ、スピンでグラム/ mlの培地密度勾配細胞分離5mlの1.083に細胞懸濁液を5ml層ブレーキなし/低加速しながら、室温（RT）で分。
- 新しい15 mlチューブに上清（軟膜を取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてのすべてをバックアップ）を転送して、5分間525×gでIMDM +2％FBSで1以上の洗浄を行うRT。
- 上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中にペレットを再懸濁させることによって、残りの赤血球（RBC）を溶解する。赤芽球の高い純度がある場合最後のステップ（生化学的研究用など ）で必要とされる、磁気分離による林NEG細胞に、このステップでさらにLDBM細胞を浄化する。
- LDBMまたはLIN NEG細胞 （ 図1A）から開始してex vivoで赤血球分化培養プロトコル
- 追加7ミリリットルIMDM +2％のFBS、5分およびRTでなる2mlの赤芽球増殖培地（EGM）中でペレット化した細胞を再懸濁するために525×gでスピン。
A。 STEMPRO-34培地を含む
B。 2.6％STEMPRO-34培地補充、
C。 20％BIT-9500、
D。 900 ng / mLの硫酸第一鉄、
E。 90 ng / mLの硝酸鉄、
F。 100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン
グラム。 10 -6 Mヒドロコルチゾン
H。および新たなサイトカインを追加しました：
I）100 ng / mlのSCF、
ii）の5 ng / mlのIL-3、および
III）3 IU / mlのエポ。 - 裾を使用して自動化細胞カウンターを用いてまたは手動で顕微鏡で細胞を数えるocytometer。
- 5×10 5細胞/ウェルにEGM 2.5ミリリットル（2×10 5 LDBM細胞/ ml）の最終体積の濃度で6ウェル細胞培養プレートにおいてプレートし、37°C（インキュベートこれが考慮される文化の日の＃0など）。
- 、上清の1.5ミリリットルを吸引室温で5分間525×gでスピンし、すべての3サイトカインを含有し、日中2に戻ってウェルに毎日を追加する新鮮な培地1.5mLに再懸濁することによりメディアを変更し、3、4、最適化する増殖期。 3日目に、すべての細胞を除去カウントし、約2×10 5細胞/ mlの細胞ウエル濃度を維持するために適切な数のウェルに分割する。 37℃/ 5％CO 2で培養物を維持する。
- 4日目に、新たな細胞培養6ウェルプレートのウェルにプレートMS5細胞（マウス間質細胞株）。 MS5細胞培養培地は、20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有するα-MEMである。
- 5日目に、数を数える血球計数器を用いて顕微鏡で自動細胞カウンターを用いてまたは手動で元の培養プレートの各ウェル中の細胞（現在著しく赤芽球に富む）。
- 各ウェルからすべてのセルを持ち上げて、15 mlのコニカルチューブに移し、室温で5分間525×gでスピンダウンし、上清を吸引し、および2×10の濃度にのみEPO（3 IU / ml）を含む新鮮なEGMでペレットを溶解5細胞/ ml。
- MS-5細胞は、前日めっき（共培養時には70〜80％の集密度をターゲット）とEPOのみの（ではないが、その培地を含むEGMでこれらのウェル中の赤血球細胞を追加したウェルから上清を吸引し選択は、MS-5細胞）数日間、EGMでよく生き残る。
- 日の＃6に新鮮なEPOを追加する培地交換。
- 無添加サイトカインとEGMを使用して、その日の＃7にメディアを変更します。毎日、抗TER119及びSYTO-16で染色した後、フローサイトメトリーによる除核およびp日間7〜9、試験サンプル上のマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（3章で詳述）のためのサンプルを染色するroceed。
注：メッキ前と2日目に、4、6、および培養7、サイズ（FSC）対表面マーカーCD44およびTER119を評価することにより、フローサイトメトリーで赤芽球濃縮および分化のための培養細胞をモニター9また、CD71、TER119、およびFSC。また、10、11を使用することができる。
- 追加7ミリリットルIMDM +2％のFBS、5分およびRTでなる2mlの赤芽球増殖培地（EGM）中でペレット化した細胞を再懸濁するために525×gでスピン。
2。高速除核アッセイ、吉田らが記載したプロトコルに従って。変更した12（図1B）
- in vitroの赤血球生成培養のためのストレス赤血球生成誘導と間質細胞調製
- 動物実験委員会のガイドライン（ 例えばイソフルラン溶液による）あたりの2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを麻酔。マウスが十分に緩やかな後足のピンチに反射的反応の欠如のためにとのチェックをして麻酔されていることを確認してください手順の間に定期的な呼吸。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医眼軟膏を使用してください。
- 500μLの最終容量に出血尾を経由して、ストレス赤血球生成を誘導する。インスリン注射器を用いて、動物の腹腔内に流体蘇生（注入する前に、トレンデレンブルグ体位に動物を保持し、内臓を傷つけないように下腹部に注射する）を保証するために生理食塩水を等量のを注入する。
- ケージの周りを移動し始めと陥ることなく、立って歩くことができるという動物によって示されるように、モータ制御を取り戻したまで無人マウスを放置しないでください。 phlebotomizedマウスは他のマウスなしでケージに入れている。
- 2日後、24ウェル細胞培養プレートのウェル中のMS-5細胞をプレート。 70〜80であることを目標とMS5細胞培地中で37℃/ 5％CO 2（20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有する-MEM）でのMS-5細胞をインキュベート％コンフルエントのI48時間後、n個のプレートウェル。
- 脾細胞の脾臓および処理の収穫
- 四日（96時間）ストレス赤血球生成誘導後、動物実験委員会が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入）を通じて以前に出血させ、マウスを安楽死させる。
- 収穫脾臓とIMDM 2％FBSを含む15 mlのコニカルチューブに入れ、氷上に保つ。
- 背中の研究室では、無菌条件下で組織培養フード内で、50 mlチューブの上にセットさ40μmのセルストレーナーに脾臓を含むチューブを反転させる。 5 mlのプラスチックシリンジのプランジャーを使用して脾臓をつぶす。
- IMDM +2％FBSを細胞ストレーナーを洗浄し、同じ培地を用いて、5mlまでの細胞懸濁液の最終体積を調整します。
- 慎重にブレーキなし/低加速して、室温で25分間750×gで15 mlチューブとスピンで5ミリリットルの密度勾配細胞分離培地1.083グラム/ミリリットルで5ミリリットル脾臓細胞浮遊液を重ね。
- 転送新しい15 mlチューブに、室温で5分間525×gでIMDM +2％FBSを含む1以上の洗浄を行い、上清（バフィーコートを取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてまで溶液） 。
- 上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中でペレットを再懸濁することによって赤血球を溶解する。
- 7ミリリットルIMDM +2％のFBSで細胞を洗浄し、4℃で5分間、525×gでRBC溶解緩衝液とスピンを希釈し、中和するために追加
- 上清を吸引し、および赤芽球増殖培地（EGM）2mlにペレット化した細胞を一時停止。
- プラスチック上の赤芽球が濃縮された孤立した低密度脾細胞、（高速のin vitro赤血球生成文化の第一段階）の培養
- 自動細胞カウンターにまたは手動で、血球計数器で細胞を数える。この段階では、脾臓当たりの単離された細胞の通常の数は、約15×10 6である。
- fで（サイトカインを含む更なるEGM内のセルを一時停止inal濃度）：SCF 50 ng / mlのIL-3 5 ng / mlの、そしてエポ2単位/ ml。
- / 24ウェル細胞培養プレートを1ml /ウェル（ウェルの細胞の総数に応じて当たりのセルの数が同じ）の最終体積中で、37℃でO / Nインキュベート板1〜5×10 6細胞5％CO 2。
- MS5細胞に対する赤芽球の培養物（ 体外赤血球産生培養において 、高速の第二段階
- 吸引穴プラスチックからの上清各ウェルに氷の上に、5分間PBS中に冷たい10mMのEDTAの2ミリリットルを追加することによって、（強く赤芽球が濃縮された）細胞を持ち上げる。
- （サイトカインなしで）EGMで一度洗って同じに再懸濁、新しいチューブに細胞を入れた。
- 1〜2 mLの量のプレート5×10 5 -1×10 6個の各MS5細胞で被覆された24ウェルプレートのウェル。薬理学的阻害剤は、実験に使用されている場合は、ここで適切な濃度で追加してください。
- によって導か6から8時間（時間インキュベート未処理のWTサンプル中の約30％-40％の摘出）の顕微鏡観察。 MS-5細胞に対する赤芽球の結合は、彼らの摘出を加速させる。
- 氷上で5分間、冷PBS + 10 mMのEDTAを2mlを添加することにより、各ウェルから細胞を持ち上げ。赤芽球と一緒に、MS-5細胞も収集することができるが、これらは、後で簡単にFSC こんにちは TER119として、フローサイトメトリー解析の際に除外することができます-細胞。
- この段階で、細胞をマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる分析のために固定し、染色することができる。
3。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核の間に細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化のための赤芽球の染色
- RTおよび上清を吸引し、5分間525×gでのスピン、PBS中で細胞を洗浄。
- （固定時間が反によって異なる場合があり、15分間、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド500μlの細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を固定GENはプロービング）し、穏やかにピペッティングしている。
- 1.5 mlのプラスチック製遠心管に移し、室温で15分間インキュベートする。
- 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、各チューブに500μlのPBSを添加し、緩やかにピペッティングすることによりワンウォッシュを行う。
- 20秒、吸引上清ベンチ微量2,000 XGでスピンし、少なくとも15分間氷上でチューブを保持します。透過化は、3.6から3.9は、迅速かつ効率的に行うべきであり、RTにて紡糸/吸引の後、細胞ペレットを直ちに細胞は、より自分の完全性を維持するために、氷上に戻すべきであるステップ。
- -20℃の冷凍庫からアセトン溶液を取り出し、氷上に置く。穏やかに500μlの氷冷50％アセトン（のdH 2 Oとの1:1）ピペッティングで第細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を透過。
- 20秒、吸引上清500μLに再懸濁細胞ペレット用のベンチ微量2,000 XGでのスピン60;優しくピペッティングによる氷冷100％アセトン。
- 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、静かにピペッティングして500μLの氷冷50％アセトン中でもう一度細胞ペレットを懸濁します。
- ベンチのマイクロスピン2000 20秒XG、上清を吸引し、穏やかにピペッティングすることにより冷FACSバッファー（PBS +0.5％BSA）で細胞を1回洗浄します。
- 目的の分子に対する抗体またはマーカーで標識カクテルを準備します。赤血球細胞染色用のF-アクチン染色および1μl/100μLTER119-PECy7 0.1 U/100μlのAF488-ファロイジンを。代替的または追加的染色も（1:50）、AF-594-結合コレラ毒素サブユニットB脂質ラフトを標識する（1:200）、抗pMRLC（Ser19）AF-488-抗β-チューブリン抗体を用いて行うことができる一次抗ウサギAF-488結合二次抗体（1:400）、続いて、リン酸化ミオシン制御軽鎖に対する抗体（1:50）、および抗γ-tubu抗ウサギAF-555結合二次抗体（1:300）、続いて林一次ウサギ抗体（1:100）。
- 上清を吸引後、穏やかにマーカーカクテル100μlのピペットで細胞ペレットを再懸濁し、RTで30分間インキュベートする。
- 核染色のDRAQ5の2.5μMを含むFACS緩衝液を準備します。
- ベンチマイクロ遠心にDRAQ5を含む60μlのFACS緩衝液中で20秒、吸引上清と再懸濁のために2000×gでスピンダウン、FACS緩衝液で細胞を洗浄。
- イメージングで実行試料は、撮像に固有解析ソフトウェアフローサイトメーターを用いて、実験あたり少なくとも10,000の事象を収集し、以前に公表13として生データファイルを補償し、 図2に示すように、結果を分析するフローサイトメーター。
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Representative Results
まず、細胞は、その明のアスペクト比（その長軸に対して彼らの未成年の長さの比）とそれらの明領域（その大きさの指標）に基づいて分析する。明Area値20を下回ると、200よりも高いとのイベントには、それぞれ、主に破片および細胞凝集体である、と分析（ 図2A）から除外されます。単一細胞（ゲート「R1」）は、画像の鮮鋭度を示すグラデーションRMSパラメータのためのそれらの値に基づいて分析される。ゲート「R2」がフォーカス（ 図2B）でよく撮影した画像を選択するために、50 パーセンタイル以上の勾配RMS値を持つ細胞を含む作成される。 TER119蛍光染色、平均ピクセル·パラメータ（ゲート」TER119が正」、 図2C）によって測定される細胞は、次いで、それらの明領域によって測定されるように、それらのサイズに基づいて、および赤血球マーカーTER119のためのそれらの陽性ゲートされる。 TER119のための非常に低いか、または非常に高い細胞は、それぞれ、非erythroidsまたは残りの細胞凝集体のどちらかであり、分析から除外されます。次のステップにおいて、細胞は、そのDRAQ5アスペクト比強度（それらの核の長軸対短強度の比）及びDRAQ5（ 図2D）の強度に基づいて選択される。 DRAQ5陰性細胞（ほとんどが除核など網状赤血球や赤血球などの細胞）、および低DRAQ5アスペクト比（主に二重線）を持つ細胞は、分析から除外されます。 （大部分は、この時点で赤芽球細胞ゲート「DNA陽性」、）DRAQ5陽性細胞は、その後を示し、細胞の大きさを示す彼らのTER119エリア、およびそれらのTER119平均ピクセル/エリア（TER119式の密度）に基づいて分析されTER119染色の明る。オルソ赤芽球（ゲート」OrthoE」）は、小さな、TER119 hi細胞（ 図2E）として認識されている。最後に、orthochroの亜集団マチックは非常に細胞を除核内に濃縮された赤芽球は、M01、および高いデルタ重心XY TER119による明チャネルにおける細胞画像の短径/長径の比によって計算されるセルの伸び率を測定、低明アスペクト比によって特徴付けられる初期TER119 +赤血球とDRAQ5 +核（ 図2Fにゲート」除核細胞」）の中心の中心間の距離によって定義されている/ DRAQ5、。
TER119に対する抗体およびDNAステインDRAQ5と一緒に、細胞は、赤芽球摘出7の間、F-アクチンの局在を評価するために、蛍光ファロイジンで繊維状アクチン（F-アクチン）について染色されています。注目すべきは、除核の進行が減少アスペクト比（ すなわち、ますます細長い）を有する細胞として、固定された細胞で可視化することができ、増加するデルタ重心XY Ter119/Draq5が観察される（ 図URE 3）。 F-アクチンは、除核の間の分裂溝に集中し、次いで、核が押し出されると消散することが観察される。また、初期の網状赤血球と核の間に分裂溝でアクチンとミオシンの共局在は、フローサイトメトリーpMRLC（リン酸化されたミオシン調節軽鎖）とF-アクチン7のためのWT赤芽球の共染色した後にマルチスペクトルイメージングフローによって示すことができる。
関心のある他のタンパク質と構造も除核の間に彼らの役割の研究を画像化できるように、適切な抗体または蛍光マーカーで染色することができます。偏微小管形成は、摘出前にあるが赤芽球にコルヒチン（ 図4A）で処理していないWTオルソ赤芽球に表示されます。 CEN間のパラメータのデルタ重心XY BF/Draq5を測定することによって実証されるようコルヒチンによるチューブリン重合の阻害は、細胞の分極を減少させる明視野チャンネルとDRAQ5（ 図4B）で実現核染色の中央に見られる細胞体のTER。
WTまたはRAC欠損（遺伝的または薬理学的操作の後）を利用すると、摘出におけるRacのGTPアーゼの役割を示す許可イメージング研究メトリーマルチスペクトルイメージングフローにおいて赤芽球。 RACのGTPaseは、少なくとも部分的にアクトミオシン環の形成だけでなく、初期の網状赤血球とpyrenocyte 7間の溝内の脂質ラフトの合流を調節する。
図1。研究のための除核赤芽球を製造するために使用される赤血球生成のin vitroのプロトコルの概略デモンストレーション。 A. 体外赤血球産生培養における長期initiatLDBMまたはLINからED - 。非常に瀉血による生体内でのストレス赤血球生成誘導後赤芽球が濃縮された脾細胞によって開始された細胞、Bの高速除核アッセイこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
撮像フローサイトメータに固有の分析ソフトウェアを利用してデータを図2分析目的の集団のゲーティングを連続AFのパネルに示されている。括弧内の数字は、この実験では、対応する親集団のおおよその割合を示す。R1集団のA.初期ゲーティングは細胞凝集物を除去するおよび細胞破片。B.門R2、R1のうち、フォーカス細胞外に除き、明確に画像化された細胞が含まれています。 で TER119陽性細胞（R2が入荷）TER119のためにどちらか陰性であるかである細胞を除く、選択されているあまりにも強く染色されたため、集合体におけるその存在の。（TER119陽性細胞のう ち）D. DNA陽性細胞は、核染色の強度対アスペクト比強度をプロットした後、選択されている（ここではチャンネル内に読み込まDRAQ5 5）。E.マクグラスら 5によって、以前に示したように、DNAおよびTER119陽性細胞は、好塩基性、TER119面積に対するTER119平均ピクセル内の位置に基づいて多染性およびオルソ赤芽球（ここではチャンネル3でリード）にゲートされる。 Fで除核細胞は、低アスペクト比（細胞elongatの測定を持っているオルソ赤芽球、外にそれらの細胞である明視野（BF）チャンネル）と高デルタ重心のXY Ter119/Draq5 TER119 +赤血球と核の中心を形成することが中心との（距離）におけるイオン。この研究は、もともと血液に掲載されました：コンスタンDG、Pushkaran S らシグナリングと赤芽球摘出血液中の細胞骨格の要件を。。。 2012; 119（25）:6118-6127米国血液学会によるこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。次第にデルタ重心のXY Ter119/Draq5の増加に伴って赤芽球を除核の代表的な画像 TER119-PECy7、ファロイジン-AF488およびDで染色した。野生型マウスオルソ赤芽球、raq5は、それらのアスペクト比とデルタ重心XY Ter119/Draq5ごとにゲートされる。細胞（右の上に結像セルの位置を示す黄色ゲート内に緑十字）のアスペクト比を減少させ、デルタ重心XY Ter119/Draq5の増大に対応する進行と、除核の異なる、連続するステージに固定示されている。上から下への細胞の画像では、F-アクチン（下の画像でセル＃4782に示されているように）分裂溝に集中して、核が押し出されると散逸させる除核の中に観察することができます。 表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
図4。ユニポーラ微小管集合とorthochromaの偏光の形成TIC赤芽球が脱核に先行する。 B-チューブリンが拡散して6時間コルヒチン（5μM）とともに赤芽球で染色されているのに対し、Aの極性あり、微小管形成は、（抗B-チューブリンのAlexaFluor-488および核染色をDRAQ5で染色した）対照WT赤芽球に見える速いインビトロ除核アッセイにおいて。B.マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーは、細胞体の中心間の距離を測定するパラメータデルタ重心XY BF/Draq5の分布を分析することによって、細胞の分極の定量的評価を提供することができ明視野及びDRAQ5（挿入図で模式図）で達成核染色の中心に見られるように。コルヒチン処置WTオルソ赤芽球のデルタロイドBF/Draq5値は、統計的に制御デルタロイドBF/Draq5値（P <0.001）よりも有意に異なっている。この研究は、もともとBlooのに掲載されましたD：コンスタンDG、Pushkaran S らシグナリングと赤芽球摘出における細胞骨格の要件ブラッド 。 2012; 119（25）:6118-6127米国血液学会によるこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
それはex vivoで赤血球の正常な、大規模生産を達成するために効果的に再現するのが最も困難であるインビトロ赤血球新生培養における工程であるため、近年、赤芽球除核の研究が増加する勢いを得ている。最近まで、赤芽球摘出利用主に蛍光顕微鏡の研究とは、フローサイトメトリー法。蛍光顕微鏡法は、関与する分子を同定するのに有用ではあるが、特定の時点で固定された数百のセル内の摘出を受けているオルソ赤芽球の少数を同定するための顕微鏡観察の日数を必要とする。フローサイトメトリー法、他方では、培養液中の摘出率だけでなく、このプロセスの特定の分子の薬理学的または遺伝子操作の影響を評価する上で非常に有用ですが、intracellul上のデータを提供していませんこれらの分子のARの局在。
それは、細胞の数千のフローサイトメトリーおよび形態学的データの両方の迅速な取得を可能にするので、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーは、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡の利点を兼ね備えています。赤芽球分化（前赤芽球、好塩基性、多染性、およびオルソ）のさまざまな段階で形態学的基準6を使用して定義されているので、これは、赤血球産生の研究で古典的なフローサイトメトリーに対して重要な利点である。しかし、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーは、細胞構造の可視化ではなく、個体数の相対的な定量比較のために最適である。このような比較のために、細胞内構造の免疫に必要な透過処理工程を必要としないルーチンフローサイトメトリーは、パフォーマンスが向上します。例えばBasoEの相対的な割合：PolyE： 図2EにOrthoE
撮像データは、ゲート内の特定の形態学的特徴を有する細胞の収集を可能にする、撮像フローサイトメーターに特異的な解析ソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータに関連付けて処理することができる。約100除核細胞は、より意味のある観察と統計的評価を可能にする、迅速かつ効率的な方法7に上述の分析方法10,000赤芽球の集団内で同定することができる。
また、画像処理は、核への相対的な位置、例えば研究するために、デルタ重心XYなどの特性の定量分析を可能にする撮影フローサイトメータに固有の解析ソフトにより促進される分極の測定値として使用することができる細胞質。
プロトコルおよびトラブルシューティングの中の重要なステップ
これはよくても、穏やかなピペッティングは網状赤血球およびpyrenocyte 12の分離をもたらすことができることが知られている。これは深刻な画像化摘出イベントの数を制限する可能性を秘めている。培養液中のMS5細胞に結合した赤芽球を持ち上げる場合は特にその結果、注意が必要があります。
ホルムアルデヒド溶液で固定が生じる表面マーカーの細胞外領域に変化を引き起こす可能性の特異的抗体結合の減少および/または非特異的抗体結合を増加させた。撮像フローサイトメーターの利点は、表面染色を可視化し、その品質は、このように評価することができることである。点線は、代わりに、均一に、このようなTER119などの豊富な表面マーカーの染色はoverfixationを示し、下formaldeのミックスを通じて取り組むべきハイド濃度と固定の短い期間。
固定後、少なくとも15分間、氷上で細胞を維持することは、温度差による透過化処理中に過剰な細胞破壊を防止するために不可欠である。アセトン透過性洗剤媒介透過処理よりも優れて壊れやすい後半erythroidsを維持していますが、100％のアセトンが必要なステップは、細胞の目立ったが、有害ではない、失われます。終了時に、冷FACS緩衝液で洗浄後、細胞を、抗体インキュベーションステップを室温で許可されている。
イメージングフローサイトメータを用いて、レンズに応じて流量の設定レート（細胞/秒）（速度は倍率が大きくなるにつれて減少する）を有している。測定前の最後の洗浄に続いて、細胞ペレットを、サンプルの処理を加速するために、小容量（50〜60μL）に再懸濁することをお勧めします。再度、多数のサンプルのための（30分以上）運転の帖長い期間、サンプルは氷上で保存する。
長期的な脱核アッセイは、免疫ブロッティングのような生化学的評価のために摘出段階で収集され、プルダウンをすることができる十分な細胞を生成するために拡張され、赤血球細胞産生の利点を提供しています。マウスは実験前に4日間phlebotomizedされる必要があるが、高速の脱核アッセイは、実行するための唯一の2日間を必要とする期限の利益を提供します。我々は2つの方法の間摘出効率に有意差は認められなかった。注目すべきは、7の前に説明したように、細胞内構造の免疫に必要な透過処理工程を必要としない、評価フローサイトメトリー、摘出効率を定量的に評価するために最も適しています。
技術の限界
この方法は、ここで説明したUTIlizesは、赤血球集団を増幅し、摘出した段階で、それらを同期させるために、in vitroでのヒドロコルチゾンを含む培地で、生体と文化の中でストレス赤血球生成を誘導した。これらの条件の両方が可能性が高いストレス下赤芽球、眼球摘出を模倣。また、ヒドロコルチゾンが大幅赤血球収量と生存を向上させます。ヒドロコルチゾン（したがって回避同期）することなく、定常状態の赤血球産生および培養した野生型マウス由来の骨髄細胞から摘出イベントの同じような収量を得るために、我々は複数のマウスから細胞を培養することが必要で、実行して、マルチを通じて、より多くのイベントを処理するだろうスペクトルイメージングフローサイトメトリー。マルチスペクトル画像フローサイトメトリー60倍までの拡大レンズを使用して非常に免疫蛍光顕微鏡法と比較して、形態学的データの収集を促進するが、撮像により得られた観測値の比較は、古典的な、Z-スタックしてフローサイトメーター100倍およびZスタック画像が同じでサイトメーター撮像流によって達成可能ではない構造体の3次元の印象を与えるように構成される、顕微鏡の対物レンズの倍率を提供することができるので、共焦点顕微鏡画像は、良好な細部を得るために有益であるセル。実験サイトメトリマルチスペクトルイメージングフローに集め、同様の細胞の相対数が多い、ランダム配向で、部分的に異なる視点からの観察を可能にこの制限を補償します。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者は、専門家の技術サポートのためにAmnisコーポレーション（EMD Millliporeの一部）からシンシナティ小児病院研究財団とリチャードDemarcoの、Sherree友人、そしてスコットモルデカイの研究フローサイトメトリーコアに感謝します。この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていましたK08HL088126とR01HL116352（TAK）とP30のDK090971（YZ）を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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