Summary
El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.
Abstract
La eritropoyesis en los mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación que resulta en la formación de reticulocitos. El mecanismo de la enucleación aún no ha sido aclarada completamente. Un problema común encontrado al estudiar la localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación por microscopía es la dificultad de observar un número suficiente de células sometidas a enucleación. Hemos desarrollado un protocolo de análisis novela utilizando imágenes de multiparamétrico de alta velocidad en la célula de flujo (multi-espectral de imágenes Citometría de Flujo), un método que combina la microscopía de inmunofluorescencia con citometría de flujo, con el fin de identificar de manera eficiente un número significativo de eventos enucleación, que permite obtener mediciones y realizar el análisis estadístico.
En primer lugar, describimos aquí dos métodos de cultivo in vitro en la eritropoyesis utilizados con el fin de sincronizar los eritroblastos murinos y aumentar la probabilidad de capturar la enucleación en el thtiempo e de evaluación. A continuación, se describe en detalle la tinción de eritroblastos después de la fijación y permeabilización con el fin de estudiar la localización de las proteínas intracelulares o balsas de lípidos durante la enucleación por citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Junto con el tamaño y la tinción DNA/Ter119 que se utilizan para identificar los eritroblastos ortocromáticas, utilizamos los parámetros "relación de aspecto" de una célula en el canal de campo brillante que ayuda en el reconocimiento de las células alargadas y "centroide Delta XY Ter119/Draq5 "que permite la identificación de los procesos celulares en los que el centro de la tinción Ter119 (reticulocitos naciente) está lejos del centro de la tinción DRAQ5 (núcleo de someterse a extrusión), lo que indica una celda sobre enuclear. El subconjunto de la población de eritroblastos ortocromática con alta centroide delta y baja relación de aspecto es altamente enriquecido en células enucleación.
Introduction
La diferenciación terminal dentro del linaje eritroide en mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación, a través del cual el eritroblasto ortocromática expulsa su núcleo membrana revestida (pyrenocyte) 1, lo que genera un reticulocitos 2. El mecanismo exacto de este proceso, que es también la etapa limitante de la velocidad de éxito, a gran escala, la producción de células rojas de la sangre in vitro, aún no se ha aclarado completamente. La localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación se basa en el uso de microscopía de fluorescencia y electrónica de 3-5. Este proceso tedioso típicamente resulta en la identificación de un número limitado de eventos enucleación y no siempre permite un análisis estadístico significativo. Ampliando un método de identificación eritroblasto descrito previamente por McGrath et al. 6, hemos desarrollado un nuevo método de identificación y estudio de eventos enucleación Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo (multiparamétrico de imágenes de células de alta velocidad en el flujo, un método que combina la microscopía fluorescente con citometría de flujo) 7, que puede proporcionar un número suficiente de observaciones para obtener mediciones y realizar análisis estadísticos.
Aquí, se describe primero dos métodos de cultivo in vitro en la eritropoyesis utilizados con el fin de sincronizar los eritroblastos y aumentar la probabilidad de capturar la enucleación en el momento de la evaluación. A continuación se describe en detalle la tinción de eritroblastos después de la fijación y permeabilización con el fin de estudiar la localización de las proteínas intracelulares o balsas de lípidos durante la enucleación por citometría de flujo de imágenes multiespectrales.
Las muestras se ejecutan en un flujo de imágenes citómetro y las células recogidas se gated apropiada para identificar eritroblastos ortocromáticas 6. Eritroblastos ortocromáticas Después se analizan en función de su relación de aspecto, según se mide en campo claro imaging, frente a su valor para el centroide parámetro Delta XY Ter119-ADN, que se define como la distancia entre los centros de las zonas manchadas de Ter119 y ADN, respectivamente. La población de células con una relación de aspecto de baja y alta centroide delta XY Ter119/DNA es altamente enriquecido en enucleación células. El uso de tipo salvaje (WT) eritroblastos frente eritroblastos con Mx-Cre mediada eliminación condicional de Rac1 en Rac2 - / - o combinado Rac2 - / -; Rac3 - / - de fondo genético y de este protocolo de análisis de la novela de flujo de imágenes multiespectrales citometría, hemos demostrado que la enucleación se asemeja a la citocinesis asimétrica y que la formación de un anillo de actomiosina regulada en parte por Rac GTPasas es importante para la progresión de la enucleación 7.
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Protocol
1. A largo plazo in vitro eritropoyesis Cultura (Ex vivo Eritroides Protocolo Cultura Diferenciación Giarratana et al. 8, Modificado y Adaptado por células de ratón)
Se trata de un largo plazo de 3 pasos en el protocolo de la eritropoyesis vitro. En el primer paso (días 0-4) 2 x 10 5 células / ml se colocan en medio de crecimiento suplementado con eritroblastos de factor de células madre (SCF), interleuquina-3 (IL-3), y la eritropoyetina (EPO). En el segundo paso (días 5-6), las células se resuspendieron a 2 x 10 5 células / ml y se co-cultivaron en células de estroma adherentes (MS5) en medio de crecimiento eritroblastos fresco suplementado sólo con EPO. En la tercera etapa (días 7-9), las células se cultivan en una capa de MS-5 células en medio de crecimiento fresco eritroblastos sin citoquinas hasta la enucleación (Figura 1A).
Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) deCentro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati.
- Cosecha de huesos y aislamiento de células de médula ósea de baja densidad
- Añadir 2 ml de IMDM estéril que contiene suero bovino fetal al 2% (FBS) en un tubo cónico de 15 ml y mantener en hielo.
- La eutanasia a un 2-6 meses de edad de tipo salvaje del ratón C57/BL6 (junto con o sin ratón genéticamente orientada de interés) siguiendo el protocolo institución aprobada (por ejemplo, inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical).
- Aislar los huesos de la pelvis, fémures y tibias de ambas piernas con unas pinzas y bisturí, añadirlos al tubo que contenía IMDM 2% de SFB y mantener en hielo.
- Añadir 1 ml de IMDM 2% de FBS en un tubo de citometría de flujo estéril y los huesos ras utilizando fórceps y una jeringa de tuberculina con una 25-G x 5/8 "de la aguja. IMDM al ras 2% de FBS a través de los huesos de un par de veces suavemente ( mediante la aspiración de ~ 500 l de la suspensión celular y el lavado de nuevo a través del hueso), y recoger las células de médula ósea en el flujo-cytometrtubo en Y. Flushing es completa cuando los huesos aparecen blancos.
- Filtrar suspensión de células a través de un 40-m conjunto de filtro de células en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Lavar filtro de células con IMDM 2% de FBS y utilizando el mismo medio Ajustar el volumen final de la suspensión celular a 5 ml.
- Preparar las células de médula ósea de baja densidad (LDBM) por centrifugación en gradiente de densidad: la capa cuidadosamente los 5 ml de suspensión de células en 5 ml de separación de células en gradiente de densidad medio de 1.083 g / ml en un tubo de 15 ml y centrifugar a 750 xg durante 25 min a temperatura ambiente (TA) sin freno / aceleración baja.
- Transferir el sobrenadante (todo en manos de la marca de 2 ml del tubo de 15 ml con el fin de adquirir la capa leucocitaria) a un nuevo tubo de 15 ml y llevar a cabo un lavado más con IMDM 2% FBS a 525 xg durante 5 minutos a RT.
- Aspirar el sobrenadante y lisar las células rojas de la sangre (RBC) restantes suspendiendo el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min a TA. Si una mayor pureza de eritroblastos esrequerido en el paso final (por ejemplo, para estudios bioquímicos), purificar células LDBM más a fondo en este paso para neg células Lin por separación magnética.
- Ex vivo eritroide protocolo de cultivo de diferenciación a partir de LDBM o neg células Lin (Figura 1A)
- Añadir 7 ml de IMDM 2% de FBS, centrifugado a 525 xg durante 5 min a TA y resuspender las células sedimentadas en 2 ml de medio de crecimiento eritroblastos (EGM), que consiste en:
una. Medio StemPro-34, que contiene
b. 2,6% StemPro-34 suplemento medio,
c. 20% BIT-9500,
d. Sulfato ferroso 900 ng / ml,
e. 90 nitrato férrico ng / ml,
f. 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina
g. 10 -6 M hidrocortisona
h. y citoquinas recién añadido:
i) 100 ng / ml de SCF,
ii) 5 ng / ml de IL-3, y
iii) 3 UI / ml Epo. - Contar las células utilizando un contador de células automatizado o manual en el microscopio utilizando un dobladilloocytometer.
- Placa en una placa de cultivo celular de 6 pocillos a una concentración de 5 x 10 5 células / pocillo a un volumen final de 2,5 ml en EGM (2 x 10 5 LDBM células / ml) y se incuba a 37 ° C (esto se considera como el día # 0 de la cultura).
- Cambio de medio por aspiración de 1,5 ml del sobrenadante, que gira a 525 xg durante 5 min a TA, la resuspensión en 1,5 ml de medio fresco que contiene todas las 3 citoquinas y la adición de nuevo a los pocillos cada día en día # 2, 3, 4, para optimizar fase proliferativa. El día 3, eliminar todas las células, contar y dividir en un número apropiado de pozos a fin de mantener las concentraciones de células y de ~ 2 x 10 5 células / ml. Mantener cultivo a 37 ° C / 5% de CO 2.
- El día 4, las células de la placa MS5 (línea celular estromal murina) en los pocillos de una celda de cultivo en placa de 6 pocillos nueva. El medio de cultivo celular MS5 se α-MEM que contiene 20% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina.
- El día 5, contar el número decélulas (ahora enriquecido significativamente en eritroblastos) en cada pocillo de la placa de cultivo original utilizando un contador de células automatizado o manualmente en un microscopio utilizando un hemocitómetro.
- Levantar todas las células de cada pocillo y transferir a tubos cónicos de 15 ml, centrifugar a 525 xg durante 5 min a TA, se aspira el sobrenadante y disolver gránulos con EGM fresco que contiene sólo la Epo (3 UI / ml) a una concentración de 2 x 10 5 células / ml.
- Aspirar el sobrenadante de los pocillos en los que MS-5 células se sembraron el día anterior (orientada al 70-80% de confluencia en el momento de co-cultivo) y se añaden a las células eritroides en estos pozos en EGM contiene sólo Epo (aunque no es su medio de elección, MS-5 células sobreviven bien en EGM durante varios días).
- Cambie medio adición fresca EPO en el día # 6.
- Cambie medio en el día n º 7, usando EGM sin citoquinas añadidas. En los días 7 al 9 de muestras para descartar la enucleación con citometría de flujo después de la tinción con anti-Ter119 y Syto-16 todos los días y proceed de la tinción de muestras para múltiples imágenes espectrales Citometría de Flujo (como se detalla en la sección 3).
Nota:. Antes de chapado y en el día 2, 4, 6, y 7 de cultivo, las células cultivadas para controlar el enriquecimiento de los eritroblastos y la diferenciación con citometría de flujo mediante la evaluación de los marcadores de superficie CD44 y Ter119 vs tamaño (FSC) 9 Alternativamente CD71, Ter119, y FSC también se puede utilizar 10, 11.
- Añadir 7 ml de IMDM 2% de FBS, centrifugado a 525 xg durante 5 min a TA y resuspender las células sedimentadas en 2 ml de medio de crecimiento eritroblastos (EGM), que consiste en:
2. Ensayo Enucleación rápida, De acuerdo con el protocolo descrito por Yoshida et al. 12 con modificaciones (Figura 1B)
- El estrés de la inducción de la eritropoyesis y estroma preparación de células para el cultivo in vitro de la eritropoyesis
- Anestesiar a un 2-6 meses de edad de tipo salvaje C57/BL6 ratón por directrices IACUC (por ejemplo, con una solución de isoflurano). Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado adecuadamente mediante la comprobación de la ausencia de respuestas reflejas a un suave pellizco pata trasera y pararespiración regular durante el procedimiento. Utilice veterinario pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Inducir la eritropoyesis estrés a través de la cola sangrado hasta un volumen final de 500 l. Usando una jeringa de insulina, inyecte un volumen igual de solución salina normal por vía intraperitoneal para asegurar la reposición de líquidos del animal (mantenga animales en posición de Trendelenburg antes de inyectar e inyectar en la parte inferior del abdomen, para no dañar los órganos internos).
- No deje el ratón sin atención hasta que se haya recuperado el control del motor, como se indica por el animal comienza a moverse alrededor de la jaula y ser capaz de ponerse de pie y caminar sin caerse. El ratón Phlebotomized se coloca en una jaula sin otros ratones.
- Después de 2 días, placa MS-5 células en pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Incubar MS-5 células a 37 ° C / 5% de CO2 en medio celular MS5 (a-MEM que contiene 20% de SFB, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina) con el objetivo de ser 70-80 % confluentes ipozos n de la placa después de 48 hr.
- Cosecha del bazo y el procesamiento de los esplenocitos
- Cuatro días (96 horas) después de la inducción de la eritropoyesis estrés, practicar la eutanasia previamente purgado del ratón a través del protocolo aprobado por el IACUC (por ejemplo, inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical).
- Bazo Harvest y lo puso en un tubo cónico de 15 ml que contenía IMDM FBS al 2% y mantener en hielo.
- De vuelta en el laboratorio, en la campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles, invierta el tubo que contiene el bazo-en un filtro de células de 40 m situada en la parte superior de un tubo de 50 ml. Crush bazo utilizando el émbolo de una jeringa de plástico de 5 ml.
- Lavar filtro de células con IMDM 2% de FBS y utilizando el mismo medio, ajustar el volumen final de la suspensión celular a 5 ml.
- Capa cuidadosamente la suspensión de esplenocitos 5 ml en 5 ml de densidad de separación celular gradiente medio de 1.083 g / ml en un tubo de 15 ml y centrifugar a 750 xg durante 25 min a temperatura ambiente sin freno / bajo aceleración.
- Transferenciasobrenadante (solución hasta aproximadamente la marca de 2 ml del tubo de 15 ml con el fin de adquirir la capa leucocitaria) a un nuevo tubo de 15 ml y llevar a cabo un lavado más con IMDM 2% de SFB a 525 xg durante 5 min a TA .
- Aspirar el sobrenadante y lisar las células rojas de la sangre mediante la suspensión el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min a TA.
- Añadir 7 ml de IMDM 2% de FBS para lavar las células y para diluir y neutralizar el tampón de lisis de RBC y centrifugado a 525 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y suspender las células peletizadas en 2 ml de medio de crecimiento eritroblastos (EGM).
- Cultura de los esplenocitos aislados de baja densidad, enriquecidas en eritroblastos, en plástico (primera etapa de la cultura de la eritropoyesis rápido in vitro)
- Contar las células en un contador de células automatizado o manualmente por un hemocitómetro. Número habitual de células aisladas por el bazo en esta etapa es de ~ 15 x 10 6.
- Suspender las células más en EGM contienen las citocinas (a fconcentraciones de nal): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, y la OEP 2 U / ml.
- Plate 1-5 x 10 6 células en un volumen final de 1 ml / pocillo (mismo número de células por pozo, dependiendo del número total de células) de una placa de cultivo celular de 24 pocillos y se incuban O / N a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Cultura de eritroblastos en las células MS5 (segunda etapa de la cultura de la eritropoyesis rápido in vitro
- Aspirar el sobrenadante de la plástico bien y levantar las células (altamente enriquecidas en eritroblastos) mediante la adición de 2 ml de frío de EDTA 10 mM en PBS durante 5 min, en hielo a cada pocillo.
- Poner las células en tubos frescos, lavar una vez en EGM (sin citoquinas) y volver a suspender en el mismo.
- Plate 5 x 10 5 -1 x 10 6 células en un volumen de 1-2 ml a cada MS5 celular recubierto pocillo de una placa de 24 pocillos. Si inhibidores farmacológicos están siendo utilizados en el experimento, añadirlos a concentraciones apropiadas ahora.
- Incubar durante 6 a 8 horas (tiempo guiado porobservación microscópica de aproximadamente 30% -40% enucleación en el peso de la muestra no tratada). La unión de los eritroblastos de MS-5 células acelera su enucleación.
- Levante las células de cada pocillo mediante la adición de 2 ml de EDTA frío PBS + 10 mM, durante 5 minutos, en hielo. Junto con los eritroblastos, también se recogerán MS-5 células, pero estos más tarde se pueden excluir fácilmente durante el análisis de citometría de flujo como FSC hi Ter119 - células.
- En esta etapa, las células se pueden fijaron y se tiñeron para el análisis en un Multi-espectral de imágenes citometría de flujo.
3. La tinción de Eritroblastos para la localización intracelular de proteínas o lípidos balsas Durante enucleación por multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo
- Lavar las células en PBS, girar 525 xg durante 5 min a TA y se aspira el sobrenadante.
- Fijar las células resuspendiendo los sedimentos celulares en 500 l de 3,7% de formaldehído en PBS durante 15 min (tiempo de fijación puede variar dependiendo de la lucha contrase sondeó generación) y pipeteando con suavidad.
- Transferencia a tubos de centrífuga de plástico de 1,5 ml y se incuba durante 15 min a TA.
- Centrifugado en un banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, se aspira el sobrenadante y llevar a cabo un lavado mediante la adición de 500 l de PBS a cada tubo y pipeteado suavemente.
- Haga girar en un banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y mantener los tubos en hielo durante al menos 15 min. Permeabilización los pasos 3.6 a 3.9 se debe hacer de manera rápida y eficiente, y siguiendo spinning / aspiración a temperatura ambiente, los sedimentos celulares inmediatamente debe ser puesto de nuevo en hielo, para que las células conserven mejor su integridad.
- Tomar soluciones de acetona a partir de -20 ° C congelador y poner en hielo. Permeabilizar las células mediante resuspensión sedimentos celulares por primera vez en 500 l helado 50% de acetona (1:1 con dH 2 O) y pipeta suavemente.
- Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, el sobrenadante aspirado y teléfonos resuspender pellets en 500 l60; helado acetona al 100% con la pipeta suavemente.
- Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, el sobrenadante aspirado y teléfonos resuspender gránulos una vez más en 500 l helado acetona al 50% con la pipeta suavemente.
- Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y lavar las células una vez en tampón FACS frío (PBS + BSA al 0,5%) con la pipeta suavemente.
- Preparar cóctel de marcaje con anticuerpos o marcadores para las moléculas de interés: 0,1 U/100 l AF488-faloidina para la tinción de actina F y 1 μl/100 l Ter119-PECy7 para la tinción de células eritroides. Tinción alternativa o adicional también se puede hacer uso de AF-488-anti-β-tubulina de anticuerpos (1:50), AF-594-conjugado toxina del cólera subunidad B para etiquetar las balsas de lípidos (1:200), anti-pMRLC (Ser19) anticuerpo primario durante la miosina fosforilada cadena ligera reguladora (01:50), seguido de conejo anti-AF-488-conjugado secundaria de anticuerpos (1:400) y anti-γ-tubulin anticuerpo primario de conejo (1:100) seguido por anti-conejo anticuerpo secundario AF-555-conjugado (1:300).
- Después de la aspiración sobrenadante, resuspender los sedimentos celulares en 100 l de cóctel de marcador, pipeta suavemente y se incuba durante 30 min a TA.
- Preparar tampón FACS que contiene 2,5 M de DRAQ5 la tinción nuclear.
- Lavar las células en tampón FACS, girar hacia abajo en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y resuspender en 60 l de tampón FACS que contiene DRAQ5.
- Corra las muestras en el citómetro de flujo de imágenes para recoger al menos 10.000 eventos por cada experimento, compensar a los archivos de datos brutos según lo publicado previamente 13, y analizar los resultados, como se muestra en la figura 2, utilizando el software de análisis específico de la proyección de imagen citómetro de flujo.
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Representative Results
En primer lugar, las células se analizaron sobre la base de su relación de aspecto de campo claro (la relación de la longitud de su menor en comparación con su eje mayor) y su área de campo claro (indicativo de su tamaño). Los eventos con un valor de campo claro de la zona inferior a 20 y superior a 200 son en su mayoría de los desechos celulares y agregados, respectivamente, y se excluyeron del análisis (Figura 2A). Las células individuales (gate "R1") son luego analizadas en función de su valor para el parámetro Gradient RMS, lo que indica la nitidez de la imagen. Gate "R2" se crea con las células que contienen el valor RMS de degradado más de los 50 º percentil en el fin de seleccionar las imágenes tomadas con mucha atención (Figura 2B). Después las células se gated sobre la base de su tamaño, medido por su área de campo claro, y su positividad para el Ter119 marcador de eritroide como se mide por el parámetro mancha-Media de pixel Ter119 fluorescente (puerta "Ter119 positivo", Figura 2C). Las células muy bajas o muy altas para Ter119, son o no eritroides o agregados de células que quedan, respectivamente, y se excluyeron del análisis. En el siguiente paso, se seleccionan las células en base a su DRAQ5 Relación de Aspecto Intensidad (la relación del menor frente a la intensidad eje mayor de su núcleo) y la intensidad de DRAQ5 (Figura 2D). DRAQ5 células negativas (células mayoría enucleados, como reticulocitos y glóbulos rojos) y células con una baja relación de aspecto DRAQ5 (en su mayoría dobletes) están excluidos del análisis. DRAQ5 células positivas (puerta "de ADN positivo", la mayoría de los eritroblastos en este punto) se analizan a continuación en base a su Zona Ter119, que indica el tamaño de la célula, y su Ter119 Media de pixel / área (densidad de expresión Ter119), que indica la brillo de tinción Ter119. Eritroblastos ortocromáticas (gate "OrthoE") son reconocidos como células pequeñas, Ter119 hi (Figura 2E). Por último, una subpoblación de la orthochroMatic eritroblastos altamente enriquecido en enucleación células se caracteriza por una baja relación de aspecto de campo claro, que es una medida de la elongación celular, calculada por la relación de eje / eje mayor de menor importancia de la imagen de la célula en el canal de campo claro M01, y por la alta Delta centroide XY Ter119 / DRAQ5, que se define por la distancia entre el centro de la incipiente Ter119 +-reticulocitos y el centro de la DRAQ5 +-núcleo (GATE "células enucleación" en la Figura 2F).
Junto con anticuerpo contra Ter119 y la DRAQ5 ADN-tinción, las células también se han teñido para la actina filamentosa (F-actina) con faloidina fluorescente para evaluar la localización de F-actina durante la enucleación eritroblastos 7. Es de destacar que una progresión de la enucleación puede ser visualizado en las células fijas, como las células con una relación de aspecto decreciente (es decir, cada vez más alargada) y se observó el aumento de centroide delta XY Ter119/Draq5 (Fig.Ure 3). Se observa la F-actina para concentrarse en el surco de segmentación durante la enucleación y luego disipar una vez que se extruye el núcleo. Por otra parte, la co-localización de la actina y la miosina en el surco de segmentación entre reticulocitos incipiente y el núcleo se puede demostrar por el flujo de imágenes multiespectrales citometría después de la co-tinción de eritroblastos WT para pMRLC (miosina fosforilada de la cadena ligera reguladora) y F-actina 7.
Otras proteínas y estructuras de interés también pueden ser teñidas con anticuerpos apropiados o marcadores fluorescentes para permitir los estudios de imagen de su papel durante la enucleación. La formación de microtúbulos polarizada es visible en eritroblastos ortocromáticas WT antes de la enucleación, pero no en los eritroblastos tratados con colchicina (Figura 4). La inhibición de la polimerización de tubulina por colchicina disminuye la polarización celular, como se demuestra mediante la medición de la centroide parámetro Delta XY BF/Draq5 entre el CENter del cuerpo celular visto en el canal claro y el centro de la tinción nuclear alcanzado con DRAQ5 (Figura 4B).
Utilizando WT o Rac-deficiente (después de la manipulación genética o farmacológica) eritroblastos en el flujo de imágenes multiespectrales citometría de estudios de imagen permitieron que demuestran el papel de Rac GTPasas en la enucleación. Rac GTPasas regulan al menos en parte la formación de un anillo de actomiosina, así como la confluencia de las balsas lipídicas en el surco entre reticulocitos incipiente y pyrenocyte 7.
Figura 1. Demostración esquemática de los protocolos de la eritropoyesis in vitro utilizados para producir eritroblastos enucleación para los estudios. A. a largo plazo en la cultura de la eritropoyesis vitro iniciated de LDBM o Lin -.. células B. ensayo enucleación Fast iniciado por esplenocitos altamente enriquecidas en eritroblastos después de la inducción de la eritropoyesis estrés in vivo mediante flebotomía Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de los datos utilizando el software de análisis específica para el flujo de imágenes citómetro. Gating sucesiva de las poblaciones de interés se muestra en los paneles de AF. El número entre paréntesis indica el porcentaje aproximado de la población de padres correspondiente, en este experimento. A. compuerta inicial de la población R1 elimina los agregados de célulasy restos celulares. B. Puerta de R2 desde R1 incluye las células que han sido fotografiados claramente, con exclusión de células de enfoque. células Ter119-positivos C. (de R2) se seleccionan, con exclusión de células que son ya sea negativo para Ter119 o están demasiado intensamente manchada debido a su presencia en los agregados. se seleccionan las células de ADN positivas D. (fuera de las células Ter119-positivos), después de trazar para Intensidad Relación de aspecto frente a la intensidad de la tinción nuclear (aquí DRAQ5 leído en el canal 5). E. células con el ADN y Ter119-positivas tienen puertas en basófilos, policromatófilo y eritroblastos ortocromáticas función de su ubicación en el Ter119 Mean pixel frente Ter119 Área (aquí leen en el canal 3), como se muestra anteriormente por McGrath et al 5. F. Las células enucleación son aquellas células de los eritroblastos ortocromáticas, que tienen relación de aspecto baja (una medida de la célula alargadaiones en campo claro (BF) de canal) y de alta Delta Centroid XY Ter119/Draq5 (distancia entre el centro de formación de Ter119 +-reticulocitos y el centro del núcleo). Esta investigación fue publicada originalmente en la sangre: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al Señalización y requisitos del citoesqueleto en la enucleación eritroblasto Sangre... 2012,. 119 (25) :6118-6127 por la Sociedad Americana de Hematología Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes representativas de enucleación eritroblastos con aumento progresivo Delta Centroid XY Ter119/Draq5. WT ratón eritroblastos ortocromáticas, manchados con Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, y Draq5, están cerrada por su relación de aspecto y delta centroide XY Ter119/Draq5. Las células se muestran fijo en diferentes etapas sucesivas, de la enucleación, con una progresión que corresponde a la disminución de la relación de aspecto y el aumento de centroide Delta XY Ter119/Draq5 (verde-cruz dentro de la puerta amarilla muestra la posición de la celda reflejado a la derecha). En las imágenes de celda de arriba a abajo, F-actina se puede observar durante la enucleación de concentrarse en el surco de segmentación y luego disiparse una vez que se extruye el núcleo (como se muestra en la celda # 4782 en la imagen inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4. Formación de un ensamblaje de los microtúbulos unipolar y la polarización de orthochromaeritroblastos tic precede a la enucleación. A. Polarized la formación de microtúbulos es visible en eritroblastos de control WT (teñidas con anti-b-tubulina-AlexaFluor-488 y la DRAQ5 tinción nuclear), mientras que b-tubulina se tiñe difusamente en los eritroblastos incubadas con colchicina (5 M) durante 6 horas en el ensayo in vitro de la enucleación rápido en. B. multi-espectral citometría de flujo de imágenes puede ofrecer una evaluación cuantitativa de la polarización celular mediante el análisis de la distribución del parámetro de Delta centroide XY BF/Draq5, que mide la distancia entre el centro del cuerpo de la célula como se ve en campo brillante y el centro de la tinción nuclear alcanzado con DRAQ5 (representación esquemática en el recuadro). Los valores delta centroide BF/Draq5 de eritroblastos ortocromáticas WT tratados con colchicina son estadísticamente significativamente diferente que el control de los valores de Delta centroide BF/Draq5 (p <0,001). Esta investigación fue publicada originalmente en Blood:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al Señalización y requisitos del citoesqueleto en la enucleación eritroblasto Sangre. 2012,. 119 (25) :6118-6127 por la Sociedad Americana de Hematología Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En los últimos años el estudio de la enucleación eritroblastos ha adquirido cada vez mayor impulso, ya que es el paso en cultivos in vitro de la eritropoyesis en que es más difícil de reproducir de manera eficiente con el fin de lograr éxito, la producción a gran escala de células rojas de la sangre ex vivo. Hasta hace poco, el estudio de la enucleación eritroblasto utilizó la microscopía de fluorescencia, principalmente y citometría de flujo métodos. Métodos de microscopía de fluorescencia, aunque útil en la identificación de moléculas que participan, requieren días de observación microscópica para identificar un pequeño número de eritroblastos ortocromáticas sometidos a enucleación dentro de cientos de células fijadas en un punto particular en el tiempo. Citometría de métodos de flujo, por otro lado, son muy útiles en la evaluación de la tasa de enucleación en una cultura, así como los efectos de la manipulación farmacológica o genética de moléculas particulares en este proceso, pero no proporcionan ningún dato sobre la intracellulAR localización de estas moléculas.
Flujo de imágenes multiespectrales combina citometría de los beneficios de la citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia, ya que permite la adquisición rápida de ambos de citometría de flujo y los datos morfológicos en varios miles de células. Esta es una ventaja significativa frente de flujo clásico de citometría en los estudios de la eritropoyesis, ya que las diferentes etapas de la diferenciación de eritroblastos (proeritroblastos, basófilo, policromatófilo, y ortocromática) han sido definidos utilizando criterios morfológicos 6. Sin embargo, multiespectral citometría de flujo de formación de imágenes es óptima para la visualización de las estructuras celulares en lugar de comparaciones cuantificación relativa en las cifras de población. Para tales comparaciones, rutina de citometría de flujo que no requiere el paso necesario para la permeabilización de inmunofluorescencia de las estructuras intracelulares se comporta mejor. Por ejemplo el porcentaje relativo de BasoE: PolyE: OrthoE en la Figura 2E
Los datos de imágenes pueden ser procesados en asociación con la citometría de flujo de datos utilizando el software de análisis específica para el flujo de imágenes citómetro, permitiendo la recogida de células con ciertas características morfológicas dentro de puertas. Aproximadamente un centenar de células enucleación pueden ser identificados dentro de una población de 10.000 eritroblastos con el método de análisis descrito anteriormente de una manera rápida y eficiente 7, lo que permite observaciones más significativos y la evaluación estadística.
Por otra parte, el procesamiento de imágenes se facilita con el software de análisis específica para el flujo de imágenes citómetro de permitir el análisis cuantitativo de características tales como el delta del centroide XY para estudiar por ejemplo, la posición relativa del núcleo ael citoplasma que se puede utilizar como una medida de la polarización.
Los pasos críticos en el protocolo y la resolución de problemas
Es bien conocido que incluso pipeteo suave puede resultar en la separación de reticulocitos y pyrenocyte 12. Esto tiene el potencial de limitar severamente el número de eventos enucleación de imágenes. Como resultado, se debe tener cuidado, especialmente al levantar eritroblastos unidos a células MS5 en la cultura.
La fijación con solución de formaldehído puede causar alteraciones a las regiones extracelulares de los marcadores de superficie resultantes en anticuerpo específico disminución de la unión y / o aumento de la unión de anticuerpo no específica. Una ventaja de la formación de imágenes citómetro de flujo es que tinción de la superficie se visualiza y su calidad por lo tanto se puede evaluar. Punteada, en lugar de uniforme, la tinción de los marcadores de superficie abundantes como Ter119 indica overfixation y debe abordarse a través de una mezcla de formaldehído menorconcentración hyde y una menor duración de la fijación.
Después de la fijación, manteniendo las células en hielo durante al menos 15 min es de vital importancia con el fin de prevenir el exceso de la rotura de células durante el proceso de permeabilización debido a las diferencias de temperatura. Aunque la permeabilización acetona mantiene los eritroides finales de los frágiles mejor que la permeabilización mediada por detergente, el paso donde se requiere 100% de acetona dará lugar a una notable, pero no perjudicial, pérdida de células. Al final, después de un lavado con tampón FACS frío, las células se les permite a temperatura ambiente durante los pasos de incubación de anticuerpos.
El flujo de imágenes tiene citómetro de una tasa fija de flujo (células / seg) dependiendo del objetivo utilizado (tasa disminuye a medida que aumenta la magnificación). Tras el lavado final antes de la medición, se recomienda que los sedimentos celulares se resuspendieron en un volumen pequeño (50-60 l), con el fin de acelerar el procesamiento de la muestra. Para un gran número de muestras que reQuire larga duración de la ejecución (durante 30 min), las muestras se deben mantener en hielo.
El ensayo de la enucleación largo plazo ofrece el beneficio de una producción de células eritroides ampliado con el fin de producir suficientes células que se pueden recoger en la etapa de la enucleación para evaluación bioquímica como inmunotransferencia y desplegables. El ensayo de la enucleación rápido da el beneficio de tiempo que requiere sólo 2 días para llevar a cabo, aunque un ratón necesita ser Phlebotomized 4 días antes del experimento. No hemos observado una diferencia significativa en la eficiencia de la enucleación entre los dos métodos. De nota, citometría de flujo de evaluación, que no requiere la etapa de permeabilización necesario para inmunofluorescencia de las estructuras intracelulares, tal como se describe antes de 7, es más apropiado para la evaluación cuantitativa de la eficiencia de la enucleación.
Limitaciones de la técnica
El método descrito aquí utilizes inducidos eritropoyesis estrés in vivo y la cultura en un medio que contiene hidrocortisona in vitro con el fin de amplificar las poblaciones eritroides y sincronizarlos en la etapa de la enucleación. Ambas condiciones probablemente imitan eritroblasto-enucleación bajo estrés. Además, hidrocortisona aumenta significativamente el rendimiento de eritroide y la supervivencia. Para obtener un rendimiento similar de eventos enucleación de células de médula ósea procedentes de ratones de tipo salvaje con la eritropoyesis en estado estacionario y se cultivan sin hidrocortisona (sincronización evitando así), tendríamos que cultivar células de varios ratones y correr y procesar mucha más eventos a través de múltiples -espectral Imaging Citometría de Flujo. Aunque el flujo de imágenes multiespectrales acelera citometría de colección de datos morfológicos enormemente en comparación con la microscopía de inmunofluorescencia utilizando la lente de aumento de hasta 60x, la comparación de las observaciones obtenidas por imágenes de citómetro de flujo con el clásico, Z-stack,y las imágenes de microscopía confocal es valiosa para obtener un mejor detalle, puesto que la lente objetivo en un microscopio puede proporcionar magnificación hasta 100 veces y las imágenes Z-pila dan una impresión 3-dimensional de las estructuras, que no es alcanzable por el flujo de formación de imágenes en el mismo citómetro célula. El alto número relativo de células similares recogidos en un flujo de imágenes multiespectrales citometría de experimento, en una orientación aleatoria, compensa parcialmente esta limitación permitiendo observaciones de un diferente punto de vista.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen al flujo Citometría de Investigación de la Fundación de Niños de Cincinnati Research Hospital y Richard Demarco, Sherree amigo, y Scott Mordecai desde el Amnis Corporation (parte de EMD Milllipore) para el apoyo técnico de expertos. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K08HL088126 y R01HL116352 (TAK) y DK090971 P30 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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