-النوع الفرعي انتقائية Electroporation للمن القشرية Interneurons
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
تعتمد دراسة الجهاز العصبي المركزي (CNS) على نضوج استهداف الجيني للسكان العصبية. ومع ذلك، فقد أثبتت مهمة تقييد التعبير عن الجينات التي تهم فرعية العصبية محددة صعبة بشكل ملحوظ بسبب الندرة النسبية للعناصر المروج محددة. interneurons GABAergic يشكل السكان الخلايا العصبية مع التنوع الجيني والمورفولوجي واسعة النطاق. في الواقع، تم التعرف على أكثر من 11 أنواع فرعية مختلفة من interneurons GABAergic في القشرة الماوس 1. هنا نقدم بروتوكول تكييفها لاستهداف انتقائي للسكان GABAergic. حققنا النوع الفرعي الاستهداف الانتقائي للinterneurons GABAergic باستخدام عنصر محسن من النسخ homeobox العوامل Dlx5 وDlx6، المتماثلات من ذبابة الفاكهة البعيدة أقل (دلل) الجينات 2،3، لدفع التعبير عن جينات محددة من خلال Electroporation للفي الرحم.
Introduction
الجزء الأكبر من interneurons GABAergic القشرية تنشأ من هيكلين الجنينية عابرة اسمه الفضيلة العقدية سطي والذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري على التوالي) 4. Parvalbumin والسوماتوستاتين معربا عن interneurons تنشأ في MGE حين Calretinin (CR)، Vasointestinal الببتيد (VIP) وريلين reelin (إعادة) معربا عن interneurons تنشأ من فريق الخبراء الاستشاري. هذه الأنواع الفرعية عصبون يمكن تمييزها من تواريخ ميلاد لهم. يولدون MGE فرعية مستمدة بين يوم الجنينية 9.5 (E9.5) وe16.5 5،6. في المقابل، يولدون interneurons فريق الخبراء الاستشاري المستمدة من E12.5 من خلال e18.5 مع إنتاجها تبلغ ذروتها في E15.5 6. استهداف الجيني لهذه الفئة من السكان ولدوا في وقت متأخر، ومع ذلك، لا يزال بعيد المنال.
يتم التعبير عن الفئران القاصي-أقل (DLX) حصرا الجينات في الدماغ الأمامي البطني تطوير 3. interneurons GABAergic الخلايا العصبية الإسقاط والجسم المخطط ولكن الخلايا الهرمية لا القشرية التعبير عن Dlx1، 2،5، و 6 الجينات في مراحل النمو المبكرة 3. في الواقع، يتم التعبير عن الجينات DLX في منطقة MGE وفريق الخبراء الاستشاري subventricular (SVZ) في جميع الأسلاف GABAergic. التعبير عن هذه الجينات يصبح يقتصر على تحديد الأنواع الفرعية في مراحل تالية للتفتل 7-9. أظهر الأدلة التجريبية السابق أن العنصر محسن Dlx5 / 6 يسمح للالاستهداف الانتقائي الأنساب GABAergic في نماذج الفئران المعدلة وراثيا 2. اختبرنا استخدام واحدة من هذه العناصر محسن في سياق episomal التعبير في مخ الفأر النامية. نحن الفرعية المستنسخة عنصر محسن Dlx5 / 6 جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من المروج وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في bluescript (BS) العمود الفقري بلازميد (الشكل 1). قدمنا البلازميد عن طريق Electroporation للفي الرحم في E15.5 لاستهداف انتقائي CR-، وكبار الشخصيات والمعاودة النوع الفرعي 3،8،10. لدينا تقنية تسمح ل electroporation متفرق، مما يسهلإعادة إعمار الميزات المورفولوجية الخلايا سفعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مستويات مرتفعة بشكل استثنائي في التعبير الجيني في الخلايا العصبية GABAergic القشرية تسمح للدراسات وظيفية. أجرينا الخسارة والربح من الدراسات الدالة باستخدام العديد من نوع البرية والجينات السلبية المسيطرة 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
قيود تقنية
في حين أن هذا الأسلوب يسمح للخلية التحليل المستقل للعمليات الخلية، فإنه ليست مناسبة لتحليل السكان. وelectroporations هم متفرق جدا مع أقل من ألف خلايا electroporated في الدماغ. ونتيجة لذلك، هذه التقنية لا يمكن استخدامها لتقييم العواق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لLIHONG يين للمساعدة التقنية. NVD هو حاصل على جائزة NARSAD يونغ الباحث ومدعومة أيضا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5 MH095825-02 K99). ويدعم البحوث في المختبر Fishell من قبل المعهد الوطني للصحة، والمعهد الوطني للصحة العقلية (5 MH095147-02 R01، R01 MH071679-09 5)، المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (5 R01 NS081297-02، 1 P01 NS074972 -01A1) ومؤسسة سيمونز.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
