-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
El estudio del sistema nervioso (CNS) central de la maduración depende de la orientación genética de poblaciones neuronales. Sin embargo, la tarea de restringir la expresión de genes de interés para los subtipos neuronales específicas ha demostrado ser notablemente difícil debido a la escasez relativa de los elementos específicos del promotor. Interneuronas GABAérgicas constituyen una población neuronal con amplia diversidad genética y morfológica. De hecho, más de 11 subtipos diferentes de interneuronas GABAérgicas se han caracterizado en la corteza del ratón 1. Aquí presentamos un protocolo adaptado para la orientación selectiva de poblaciones GABAérgicas. Hemos logrado subtipo dirección selectiva de las interneuronas GABAérgicas utilizando el elemento potenciador de la transcripción homeobox factores Dlx5 y Dlx6, homólogos de la (DLL)-gen distal Drosophila menos 2,3, para conducir la expresión de genes específicos a través de la electroporación en el útero.
Introduction
La mayor parte de las interneuronas GABAérgicas corticales se originan a partir de dos estructuras embrionarias transitorias nombradas las eminencias ganglionares medial y caudal (MGE y CGE, respectivamente) 4. Parvalbúmina y somatostatina expresar interneuronas se originan en el MGE mientras Calretinina (Cr), vasointestinal péptido (VIP) y Reelin (Re) que expresa interneuronas son originarios de la CGE. Estos subtipos de interneuronas pueden ser distinguidos por sus fechas de nacimiento. MGE subtipos derivados nacen entre el día embrionario 9.5 (E9.5) y E16.5 5,6. En contraste, las interneuronas CGE derivadas nacen de E12.5 E18.5 a través con su producción alcanzando un máximo de 6 E15.5. La selección genética de esta población nació tarde, sin embargo, sigue siendo difícil de alcanzar.
Los distal-less genes murinos (Dlx) se expresan exclusivamente en el prosencéfalo ventral desarrollo 3. Interneuronas GABAérgicas y las neuronas de proyección estriatales pero las células piramidales corticales no expresan Dlx1, 2,5, y 6 genes en las etapas tempranas del desarrollo 3. De hecho, los genes Dlx se expresan en la zona MGE y CGE subventricular (SVZ) en todos los progenitores GABAérgicas. La expresión de estos genes se restringe para seleccionar subtipos en las etapas postnatales 7-9. Evidencia experimental anterior mostró que el elemento potenciador Dlx5 / 6 permite el señalamiento selectivo de linajes GABAérgicas en modelos de ratones transgénicos 2. Hemos probado el uso de uno de estos elementos potenciadores en el contexto de expresión episomal en el cerebro de ratón en desarrollo. Se subclonó el elemento potenciador Dlx5 / 6 junto con un promotor mínimo y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en un Bluescript (BS) plásmido columna vertebral (Figura 1). Hemos introducido el plásmido mediante electroporación en el útero en E15.5 para atacar selectivamente Cr-, VIP e Investigación subtipos 3,8,10. Nuestra técnica permite la electroporación escasa, lo que facilitala reconstrucción de las características morfológicas de las células chamusquina. Además, los niveles excepcionalmente altos de expresión génica en neuronas GABAérgicas corticales permite para los estudios funcionales. Hemos llevado a cabo la pérdida y ganancia de estudios de la función utilizando varios tipo silvestre y genes dominantes negativos 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Limitaciones de la Técnica
Si bien esta técnica permite la célula de análisis autónoma de procesos celulares, no es adecuado para el análisis de la población. Los electroporaciones son muy escasos con menos de mil células por electroporación cerebro. Como consecuencia, la técnica no se puede utilizar para evaluar las consecuencias de comportamiento derivados de la manipulación genética de las interneuronas derivados de CGE.
Mientras electroporaciones …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a Lihong Yin para la asistencia técnica. NVD es un destinatario de un Premio al Investigador Joven NARSAD y también es apoyado por subvenciones del NIH (5 K99 MH095825-02). La investigación en el laboratorio Fishell es apoyado por el Instituto Nacional de Salud, Instituto Nacional de Salud Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) y la Fundación Simons.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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