Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
L'étude de système nerveux central (SNC) maturation repose sur le ciblage génétique des populations neuronales. Cependant, la tâche de restreindre l'expression de gènes d'intérêt à sous-types neuronaux spécifiques s'est avérée remarquablement difficile en raison de la rareté relative des éléments spécifiques de promoteurs. Interneurones GABAergiques constituent une population neuronale avec une grande diversité morphologique et génétique. En effet, plus de 11 sous-types différents d'interneurones GABAergiques ont été caractérisées dans le cortex de souris 1. Nous présentons ici un protocole adapté pour le ciblage sélectif des populations GABAergiques. Nous avons obtenu un ciblage sélectif de sous-type des interneurones GABAergiques en utilisant l'élément activateur de la transcription à homéoboîte facteurs Dlx5 et Dlx6, des homologues de la moins distale (Dll) gène Drosophila 2,3, pour entraîner l'expression de gènes spécifiques par le biais électroporation in utero.
Introduction
La majeure partie des interneurones GABAergiques corticaux proviennent de deux structures embryonnaires transitoires nommés les éminences ganglionnaires médianes et caudales (MGE et CGE respectivement) 4. Parvalbumine et la somatostatine exprimer interneurones proviennent de la MGE alors Calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) et Reelin (Re) exprimant interneurones proviennent de la CGE. Ces sous-types interneurones peuvent être distingués par leur date de naissance. MGE sous-types dérivés sont nés entre le jour embryonnaire 9.5 (de E9.5) et E16,5 5,6. En revanche, les interneurones CGE dérivés sont nés de E12.5 par a 18,5 avec leur production culminant à E15.5 6. Le ciblage génétique de cette population née fin, cependant, reste insaisissable.
Les distale moins (Dlx) gènes murins sont exclusivement exprimés dans le cerveau antérieur ventral développement 3. Interneurones GABAergiques et les neurones de projection du striatum mais cellules pyramidales corticales pas exprimer Dlx1, 2,5, et 6 gènes à des stades de développement précoces 3. En effet, les gènes Dlx sont exprimés dans la zone sous-ventriculaire MGE et CGE (SVZ) dans tous les progéniteurs GABAergiques. L'expression de ces gènes se limite à sélectionner les sous-types de stades post-mitotiques 9.7. Preuves expérimentales antérieures ont montré que l'élément Dlx5 / 6 activateur permet le ciblage sélectif de lignées GABAergiques dans des modèles de souris transgéniques 2. Nous avons testé l'utilisation de l'un de ces éléments amplificateurs dans le contexte de l'expression épisomique dans le cerveau de souris en développement. Nous avons cloné sous l'élément Dlx5 / 6 amplificatrice avec un promoteur minimal et la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) dans un bluescript (BS) squelette plasmidique (Figure 1). Nous avons introduit le plasmide au moyen d'électroporation in utero à E15.5 pour cibler sélectivement Cr, VIP et sous-types République 3,8,10. Notre technique permet clairsemée électroporation, ce qui facilitela reconstruction des caractéristiques morphologiques des cellules de singe. En outre, les niveaux exceptionnellement élevés d'expression de gènes dans les neurones corticaux GABAergiques permet pour des études fonctionnelles. Nous avons effectué la perte et le gain d'études de fonction à l'aide de plusieurs gènes de type sauvage et négatifs dominants 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Limites de la technique
Bien que cette technique permet l'analyse de cellule autonome de processus cellulaires, il n'est pas adapté à l'analyse de la population. Les électroporations sont très rares avec moins d'un millier de cellules par électroporation par le cerveau. En conséquence, la technique ne peut pas être utilisé pour évaluer les conséquences sur le comportement résultant de la manipulation génétique des interneurones CGE dérivés.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Lihong Yin pour l'assistance technique. NVD est récipiendaire d'un Prix du jeune chercheur NARSAD et est également soutenu par des subventions du NIH (5 K99 MH095825-02). La recherche dans le laboratoire Fishell est soutenu par l'Institut national de la santé, Institut national de santé mentale (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) et la Fondation Simons.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
