Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
Merkezi sinir sistemi (CNS) olgunlaşma çalışma sinirsel genetik hedefleme dayanır. Bununla birlikte, özel nöron alt tiplerine ilgi genlerinin ekspresyonunu kısıtlama görev nedeniyle spesifik promoter elementlerinin nispeten kıt olması oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. GABA'erjik internöron geniş genetik ve morfolojik çeşitliliği olan bir nöronal nüfus oluşturmaktadır. Gerçekten de, GABAerjik internöron fazla 11 farklı alt tipi fare korteksi 1 ile karakterize edilmiştir. Burada GABAerjik nüfus seçici hedefleme için uyarlanmış bir protokol mevcut. Bu homeobox transkripsiyon enhanser elemanını kullanarak, GABAerjik internöron alt tip seçici olarak hedeflenmesini elde utero elektroporasyon spesifik genlerin ekspresyonunu ile sürücü ve Dlx5 Dlx6, Drosophila uzak-az (DLL) geni 2,3 homologlarını, faktörüdür.
Introduction
Kortikal GABAerjik internöronlar toplu medial ve kaudal ganglion eminences (sırasıyla MGE ve JMO) adında iki geçici embriyonik yapılarından kaynaklanan 4. Parvalbumin ve somatostatin ifade internöron internöron JMO'ya kaynaklanan ifade Kalretinin ise MGE (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) ve Reelin (Re) köken. Bu interneuron alt tipler kendi doğum günlerinin ile ayırt edilebilir. MGE türetilmiş alt tipler embriyonik gün 9.5 (E9.5) ve e16.5 5,6 arasında doğarlar. Buna karşılık, JMO türetilmiş internöron üretim E15.5 6 seviyesinde zirve ile E18.5 yoluyla E12.5 doğar. Bu geç doğdu nüfusun genetik hedefleme, ancak, zor kalır.
Kemirgen distal-az (Dlx) genler sadece gelişmekte olan ventral önbeyin 3 olarak ifade edilmiştir. GABAerjik internöron ve striatum projeksiyon nöronları değil, kortikal piramidal hücreleri Dlx1 ifade, Erken gelişim evrelerinde 3 de 2,5, ve 6 genler. Gerçekten de, dlx genlerinin hepsi GABA'erjik atalarda MGE ve CGE subventricular (SVZ'una) olarak ifade edilmiştir. Bu genlerin sentezlenmesi postmitotik aşamalarında 7-9 de alt tiplerini belirlemek için kısıtlanır. Önceki deneysel kanıtlar Dlx5 / 6 arttırıcı bir eleman transgenik fare modellerinde 2 GABAerjik soy seçici hedefleme için izin verdiğini gösterdi. Bu, gelişmekte olan fare beyin epizomal ifade bağlamında bu zenginleştirici elemanların birinin kullanılmasını test edilmiştir. Bir minimal promotör ve Bluescript (BS) omurga plasmid olarak gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) (Şekil 1) ile birlikte Dlx5 / 6 güçlendirici elemanın alt klonlandı. Burada özellikle Cr, VIP hedef E15.5 rahimde elektroporasyon suretiyle plazmid tanıtıldı ve Yeniden 3,8,10 alt tip. Bizim teknik kolaylaştırır seyrek elektroporasyon, sağlarateşten hücrelerin morfolojik özellikleri yeniden. Buna ek olarak, kortikal nöronlarda GABAerjik gen ekspresyonu son derece yüksek seviyelerde fonksiyonel çalışmalarda da sağlar. Biz kaybı ve çeşitli yabani tip ve dominant negatif genler 11 ile fonksiyon testleri kazancını gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tekniğin Sınırlamalar
Bu teknik, hücre süreçlerinin hücre özerk analizi için sağlar, bu popülasyon analizi için uygun değildir. Electroporations beyin başına elektropore az bin hücreleri ile çok seyrek. Bunun bir sonucu olarak, bu teknik CGE türetilmiş internöron genetik manipülasyon kaynaklanan davranış sonuçlarını değerlendirmek için kullanılamaz.
Elektroporasyon E13.5-E14.5 hedef MGE türetilmiş alt tiplerinde üzerinden taşınan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz teknik yardım için Lihong Yin minnettarız. NVD bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü bir alıcı ve aynı zamanda NIH (5 K99 MH095825-02) hibe tarafından desteklenmektedir. Fishell laboratuarında Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ruh Sağlığı (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09) Ulusal Enstitüsü, Nörolojik Bozukluklar ve İnme (5 R01 NS081297-02 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen 1 P01 NS074972 -01A1) ve Simons Vakfı.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
