Класс-селективный Электропорация корковых интернейронов
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
Изучение центральной нервной системы (ЦНС) созревания зависит от генетической адресности нейронных популяций. Тем не менее, задача ограничивая экспрессию генов, представляющих интерес для конкретных нейрональных подтипов, оказалось на удивление сложным вследствие относительного дефицита конкретных элементов промотора. ГАМКергические интернейронов составляют нейронов население обширных генетических и морфологическое разнообразие. В самом деле, более 11 различных подтипов ГАМК интернейронов были охарактеризованы в коре мыши 1. Здесь мы представляем адаптированный протокол избирательный подход популяций ГАМКергические. Мы достигли подтипа избирательного выбора ГАМКергические интернейронов с помощью энхансерной элемент гомеобоксного транскрипционных факторов Dlx5 и Dlx6, гомологов дрозофилы дистальной-менее (DLL) гена 2,3, для управления экспрессией специфических генов через внутриутробное электропорации.
Introduction
Основная часть коры интернейронов ГАМКергические происходят из двух переходных эмбриональных структур, названных медиальной и хвостового ганглиозные возвышения (MGE и общего равновесия соответственно) 4. Парвальбумина и соматостатина выражая интернейронов происходят в MGE, тогда Calretinin (Cr), Vasointestinal пептид (VIP) и Reelin (Re) выражая интернейронов происходят из КГЭ. Эти интернейрон подтипов можно отличить по их датах рождения. MGE, полученные подтипы рождаются между эмбриональной день 9.5 (E9.5) и E16.5 5,6. В отличие от этого, КГЭ, полученные интернейронов рождаются из E12.5 через E18.5 с их производство достигнув E15.5 6. Генетический таргетинг этого поздно родился населения, однако, пока не удается.
Мышиные дистального-менее (DLX) гены экспрессируется исключительно в развивающихся вентральной части переднего мозга 3. ГАМКергические интернейронов и полосатого тела нейронов разбрасывания, но не корковых пирамидальные клетки выразить Dlx1, 2,5, и 6 генов на ранних стадиях развития 3. В самом деле, гены Dlx выражаются в MGE и КГЭ субвентрикулярной зоне (SVZ) во всех предшественников ГАМКергические. Экспрессия этих генов становится ограниченным, чтобы выбрать подтипы в постмитотических этапах 7-9. Предыдущий экспериментальные доказательства показали, что усилитель элемент Dlx5 / 6 позволяет избирательный подход ГАМКергических линий в трансгенных мышах 2. Мы протестировали использование одного из этих усиливающих элементов в контексте выражение эписомального в развивающемся мозге мыши. Мы суб клонировали энхансер элемент Dlx5 / 6 вместе с минимальным промотором и расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в Bluescript (BS) магистральной плазмиды (рисунок 1). Мы ввели плазмиды с помощью внутриутробно электропорации в E15.5 для селективного воздействия CR-, VIP и повторно подтипов 3,8,10. Наша методика позволяет редкой электропорации, что облегчаетреконструкция морфологических особенностей ожога клеток. Кроме того, исключительно высокие уровни экспрессии генов в нейронах коры ГАМКергические позволяет функциональных исследований. Мы провели потери и усиление функциональных исследований с использованием нескольких дикого типа и доминантных негативных генов 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ограничения техники
В то время как этот метод позволяет мобильному автономного анализа клеточных процессов, он не подходит для анализа населения. В electroporations очень редкие с менее тысячи клеток электропорации за мозга. Как следствие, этот метод не может быть использован ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Lihong Инь для оказания технической помощи. NVD является получателем NARSAD молодых исследователей премии и также при поддержке грантов NIH (5 K99 MH095825-02). Исследования в лаборатории Fishell поддерживается Национальным институтом здравоохранения, Национального института психического здоровья (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Национального института неврологических расстройств и инсульта (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) и Фонд Саймонса.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
