皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
中枢神経系（CNS）成熟の研究は、ニューロン集団の遺伝的標的化に依存しています。しかし、特定のニューロンのサブタイプに関心のある遺伝子の発現を制限するタスクが原因特定のプロモーターエレメントの相対的希少性に著しく困難なことが証明されている。 GABA作動性ニューロンは、大規模な遺伝的および形態的多様性ニューロン集団を構成している。確かに、GABA作動性介在ニューロンの11を超える異なるサブタイプは、マウスの大脳皮質1に特徴付けられている。ここでは、GABA作動性集団の選択的標的化のために適合したプロトコルを提示する。私たちは、ホメオボックス転写のエンハンサーエレメントを使用することによりGABA作動性ニューロンのサブタイプ選択的ターゲティングを達成し子宮内電気穿孔法で特定の遺伝子の発現を介して駆動するためにDLX5とDlx6、ショウジョウバエ遠位レス（DLL）遺伝子2,3のホモログを、要因。
Introduction
皮質GABA作動性介在ニューロンの大部分は、内側と尾側神経節隆起（MGEそれぞれとCGE）をという名前の2つの一過性の胚の構造から発生4。パルブアルブミンおよびソマトスタチンを発現するニューロンは、ニューロンは、CGEから発信表現カルレチニン（CR）、Vasointestinalペプチド（VIP）およびリーリン（再）に対し、MGEに由来する。これらのニューロンのサブタイプは、その誕生日によって区別することができる。 MGE派生サブタイプは胎生9.5（E9.5）とE16.5 5,6の間に生まれている。これとは対照的に、CGE派生介在ニューロンは、それらの生産がE15.5 6でピークに達してE12.5からE18.5を通して生まれている。この後半生まれの人口の遺伝的標的化は、しかし、とらえどころのないままになります。
ネズミ遠位レス（デラックス）の遺伝子はもっぱら発展途上腹側前脳3で表現される。 GABA作動性介在ニューロンと線条体投射ニューロンではなく、皮質錐体細胞がDlx1を表現、初期の発達段階3での2,5、及び6つの遺伝子。実際、 デラックス遺伝子は、すべてのGABA作動性前駆細胞におけるMGEとCGE脳室下帯（SVZ）で表現される。これらの遺伝子の発現は、有糸分裂後の段階7-9でのサブタイプを選択するために制限となる。以前の実験的証拠は、DLX5 / 6エンハンサーエレメントは、トランスジェニックマウスモデル2におけるGABA作動性系統の選択的ターゲティングを可能にすることを示した。私たちは、発生中のマウス脳におけるエピソーム発現の文脈におけるこれらのエンハンサーエレメントの1つの使用を試験した。私たちは、サブブルースクリプト（BS）骨格プラスミド（ 図1）における最小プロモーターおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）と共にDLX5 / 6エンハンサーエレメントをクローニングした。私たちは、選択的にCrイオン、VIPおよび再サブタイプ3,8,10を標的とするためにE15.5での子宮内電気穿孔中によりプラスミドを導入しました。私たちの技術は容易にスパースエレクトロポレーションを可能にする焦がす細胞の形態学的特徴の再構築。また、皮質GABA作動性ニューロンにおける遺伝子発現の非常に高いレベルの機能研究を可能にします。私たちは、いくつかの野生型およびドミナントネガティブ遺伝子11を用いた機能研究の損失と利得を実施しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
技術の限界
この技術は、細胞プロセスの細胞自律的な分析を可能にするが、それは集団分析には適していない。エレクトロポレーションは、脳あたりにエレクトロ未満千細胞と非常に疎である。結果として、この技術は、CGE由来のニューロンの遺伝子操作から生じる行動の結果を評価するために使用することができない。
エレクトロポレーションは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、技術支援のためのLihong陰に感謝しています。 NVDはNARSAD若手研究賞を受賞であり、また、NIH（5 K99 MH095825-02）からの助成金によってサポートされています。 Fishellラボでの研究は、国立衛生研究所、国立精神衛生研究所（5 R01 MH095147-02、5 R01 MH071679-09）、神経疾患·脳卒中研究所（5 R01 NS081297-02、1 P01 NS074972によってサポートされている-01A1）とシモンズ財団。
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
