Subtype-selektiv Electroporation av Cortical interneuroner
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
Studiet av sentralnervesystemet (CNS) modning er avhengig av genetisk målretting av nevronale populasjoner. Imidlertid har den oppgave å begrense ekspresjonen av gener som er av interesse for spesifikke nevronale subtyper vist seg bemerkelsesverdig utfordrende på grunn av den relative mangelen på spesifikke promoter elementer. Gabaergic interneurons utgjør en neuronal befolkning med omfattende genetisk og morfologisk mangfold. Faktisk har mer enn 11 forskjellige undertyper av gabaergic interneurons vært preget i musen cortex en. Her presenterer vi en tilpasset protokoll for selektive mål som gabaergic populasjoner. Vi oppnådde subtype selektiv målretting av gabaergic interneurons ved å bruke forsterkerelementet av homeobox transkripsjonsfaktorene Dlx5 og Dlx6, homologer av Drosophila distal løse (DLL) genet 2,3, å kjøre uttrykket av spesifikke gener gjennom in utero electroporation.
Introduction
Hovedtyngden av kortikale gabaergic interneurons stammer fra to forbigående embryonale strukturer kalt mediale og caudal ganglieblokkere eminenser (henholdsvis MGE og CGE) 4. Parvalbumin og somatostatin uttrykke interneurons opprinnelse i MGE mens calretinin (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) og Reelin (Re) uttrykker interneurons stammer fra CGE. Disse Interneuron subtyper kan være preget av deres fødselsdager. MGE avledet subtyper er født mellom embryonale dag 9,5 (e9.5) og e16.5 5,6. I kontrast er CGE avledet interneurons født fra E12.5 gjennom e18.5 med sin produksjon topp på e15.5 seks. Den genetiske målretting av dette sent fødte befolkningen imidlertid fortsatt ukjent.
De murine distal løse (Dlx) gener er utelukkende uttrykt i utviklings ventral forhjerne tre. Gabaergic interneurons og striatum-projeksjon nevroner, men ikke kortikale pyramidale celler uttrykker Dlx1, 2,5, og 6 gener på tidlige utviklingsstadier tre. Faktisk er de Dlx gener uttrykt i MGE og CGE subventricular sone (SVZ) på alle gabaergic stamfedre. Uttrykk av disse genene blir begrenset til å velge subtyper på postmitotic stadier 7-9. Forrige eksperimentelle bevis viste at Dlx5 / 6 forsterkerelement gir mulighet for selektiv målretting av gabaergic linjene i transgene musemodeller to. Vi testet ved bruk av en av disse forsterkerelementer i forbindelse med episomal ekspresjon i den tredje musehjerne. Vi sub klonet Dlx5 / 6 forsterkerelement sammen med en minimal promoter og den forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) i en Bluescript (BS) ryggrad plasmid (figur 1). Vi introduserte plasmidet ved hjelp av in utero electroporation på e15.5 å selektivt målet Cr-, VIP og re subtyper 3,8,10. Vår teknikk gjør det mulig for sparsom elektroporering, noe som lettergjenoppbygging av morfologiske trekk ved svi celler. I tillegg er de usedvanlig høye nivåer av genekspresjon i kortikale neuroner gabaergic åpner for funksjonelle studier. Vi gjennomførte tap og gevinst på funksjons studier med flere villtype og dominerende negative gener 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begrensninger av teknikken
Selv om denne teknikken gjør det mulig for celle autonom analyse av celleprosesser, er det ikke egnet for analyse populasjon. De electroporations er svært sparsommelig med mindre enn tusen celler electroporated per hjernen. Som en konsekvens, kan teknikken ikke benyttes til å vurdere atferdsmessige konsekvenser som følge av den genetiske manipulering av CGE-avledet interneuroner.
Mens electroporations utført ved e13.5-E14.5 target …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for Lihong Yin for teknisk assistanse. NVD er en mottaker av en NARSAD Young Investigator Award, og er også støttet med tilskudd fra NIH (5 K99 MH095825-02). Forskning i Fishell lab er støttet av National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Nasjonalt institutt for nevrologiske lidelser og hjerneslag (fem R01 NS081297-02, en P01 NS074972 -01A1) og Simons Foundation.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
