التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات Published: October 6, 2014 doi: 10.3791/51916

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Caroline Bonnans*^1,2, Marja Lohela*², Zena Werb²

¹Department of Oncology, INSERM U661, Functional Genomic Institute, ²Department of Anatomy, University of California

* These authors contributed equally

Abstract

خلايا الدم النخاعي هي الأكثر وفرة الخلايا المناعية داخل الأورام وثبت لتعزيز تطور الورم. تقنيات التصوير الحديثة حيوي داخلي تمكن مراقبة سلوك الخلايا الحية داخل الجهاز لكن يمكن أن يكون تحديا في بعض أنواع السرطان بسبب ورم الجهاز والوصول مثل الأمعاء. الملاحظة المباشرة من الأورام المعوية لم يتم ذكر سابقا. إجراء العمليات الجراحية الموصوفة هنا يسمح الملاحظة المباشرة للديناميات خلية الدم النخاعي داخل الأورام المعوية في الفئران الحية المعدلة وراثيا باستخدام الفئران مراسل فلوري واستشفاف طريق الحقن أو الأجسام المضادة. لهذا الغرض، تم استخدام أربعة ألوان، متعددة المنطقة،-بعدسات الصغرى القرص الغزل المجهر متحد البؤر التي تتيح التصوير المستمر طويل الأمد مع الحصول على الصور السريع. APC ^{مين / +} الفئران التي تطور أورام متعددة في الأمعاء الدقيقة وعبروا مع الفئران C-FMS-EGFP لتصور خلايا الدم النخاعي ومع الفئران ACTB-ECFPلتصور الخلايا الظهارية في الأمعاء من الخبايا. كما وصف الإجراءات لوصفها مكونات الورم مختلفة، مثل الأوعية الدموية والعدلات، وإجراءات تحديد المواقع الورم للتصوير من خلال سطح المصلي. الوقت الفاصل بين الأفلام التي تم تجميعها من عدة ساعات من التصوير تسمح للتحليل سلوك الخلية النخاعي في الموقع في المكروية المعوية.

Introduction

أدلة دامغة يوضح الآن أن المكروية الورم، وتتألف من السكان الخلية غير متجانسة، بما في ذلك الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، الخلايا المناعية والتهابات، ومصفوفة خارج الخلية، والعوامل القابلة للذوبان، يلعب دورا حاسما في بدء وتطور الأورام الصلبة من خلال المساهمة في تقريبا جميع بصمات السرطان ^1. في الواقع، خلال تطور الورم، وهناك تفاعلات ديناميكية مستمرة بين الخلايا السرطانية والخلايا تتحول انسجة أن تتطور لتوليد المكروية مواتية لخباثة ^2. بين الخلايا المناعية التي تتسلل المكروية الورم، وخلايا الدم النخاعي هي الأكثر وفرة ^3. تتألف من الضامة المرتبطة الورم (TAM)، المشتقة من خلايا النخاعي القامع (MDSCs)، والخلايا الجذعية (DC) والعدلات (PMNs)، يتم تجنيد خلايا الدم النخاعي من نخاع العظام والأورام التسلل تدريجيا، والإفراج عن السيتوكينات وعوامل النمو والبروتياز التي يمكن أن تعززتنتشر نمو الورم ^و4. الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا الدم النخاعي معقد ولكن الديناميكي. وبالتالي فهم طبيعة تفاعلاتها هو أمر حاسم لتحديد سبب هذه الخلايا تعزيز تطور السرطان بدلا من المشاركة في الاستجابة المناعية المضادة للورم، ويمكن أن تساعد على إيجاد أهداف جديدة للسيطرة عليها.

الملاحظة المباشرة من قبل intravital المجهري توفر معلومات عن ديناميات الخلايا داخل أنسجة الفئران الحية ^5. وهناك أربعة ألوان، متعددة المنطقة، وقد صمم القرص الغزل بعدسات نظام متحد البؤر الصغيرة لدراسة خلايا انسجة داخل الأورام الثديية ^6. هذا النهج يتيح التصوير المستمر على المدى الطويل، ويشمل العديد من المزايا مثل (أ) اقتناء الصور السريعة لتقليل الحركة الفنية، (ب) التخدير على المدى الطويل، (ج) أربعة اكتساب اللون لمتابعة أنواع مختلفة من الخلايا، (د) وضع العلامات الفلورية مكونات ورمي مختلفة، و (ه) مراقبة مختلف microenvironments الورم الطرافةهين نفس الماوس لتجنب الماوس لتقلب الماوس ^7-9. مع هذه التكنولوجيا، وقد تم الإبلاغ عن السلوكيات مختلفة من الخلايا في فيروس الورم الثديية (MMTV) يحركها المروج التورام منتصف T الجين الورمي (PyMT) النموذج الذي يعرض مراحل متقدمة من تكون الأورام. الخلايا اللمفاوية التائية التنظيمية (Tregs، تصور من قبل التحوير Foxp3 ^EGFP) الهجرة تفضيلي في قربها من الأوعية الدموية في حين أن البلدان النامية (CD11c و-DTR-EGFP)، الخلايا الليفية المرتبطة سرطان (Fsp1 ^{+ / +} -EGFP) وخلايا الدم النخاعي (ج-FMS -EGFP) تظهر ارتفاع الحركة في محيط الورم من داخل كتلة الورم. في حالة نقص الأكسجين الحاد النظامية، هاجرت خلايا مختلفة: Tregs وقف الهجرة على النقيض من خلايا الدم النخاعي أن مواصلة التحرك ^6. بالإضافة إلى ذلك، في نموذج الفأر نفسه، وقد تبين أن التغييرات حساسية دوكسوروبيسين مع مرحلة الورم، ويرتبط توزيع المخدرات إلى الاستجابة للدواء، ودوكسوروبيسينالعلاج يؤدي إلى تجنيد تعتمد على CCR2 من خلايا الدم النخاعي للأورام. وهكذا، ويمكن أيضا أن تستخدم التصوير الحي للحصول على نظرة ثاقبة الردود المخدرات في الموقع وبيولوجيا مقاومة كيميائية ^10،11.

رميغدي البوليبات القولونية (APC) الطفرات الجينية تحدث عادة في أورام القولون والمستقيم وسرطان الإنسان ¹² وتحور نسخة واحدة من الجين APC نتائج في المرجلات غدومي العائلية (FAP)، الذي يضفي على مخاطر عالية جدا لسرطان القولون ^13. سلالة الماوس APC ^{مين / +} يحمل طفرة اقتطاع في كودون 850 من الجين APC ويتطور بشكل عفوي أورام الأمعاء متعددة في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة ^{14- 16.} على المدى الطويل التصوير حيوي داخلي من الأمعاء يمثل تحديا بسبب الغزو من الإجراء، منذ فتح التجويف البريتوني من الضروري للوصول إلى الأمعاء. على المدى القصير التصوير الحي الحادي وتم udies المنشورة سابقا على الأمعاء صحي ^17،18، ولكن لم يتم الإبلاغ عن الملاحظة المباشرة طويلة الأجل الأورام المعوية. وقد تم تصميم وإجراء العمليات الجراحية وصقلها لتصور الأورام من خلال سطح المصلي للأمعاء، وذلك باستخدام نظام الغزل حيوي داخلي المجهري القرص المستخدمة سابقا لأورام الثدي صورة ^6،10. في هذه الورقة، وصفت البروتوكول الذي يسمح احد لاتباع سلوك خلايا الدم النخاعي داخل الأورام في الأمعاء الدقيقة باستخدام APC ^{مين / +} الفئران.

Protocol

ملاحظة: أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للإجراءات التي أقرتها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC)، UCSF. كانت جميع تجارب التصوير إجراءات عدم البقاء على قيد الحياة والموت الرحيم كانت الحيوانات مباشرة بعد نهاية الحصول على الصور.

1. جيل من الفئران

ملاحظة: APC ^{مين / +} الفئران، والتي تحمل طفرة في الجين APC وتطوير 50-100 أورام تلقائيا في الأمعاء الدقيقة.

1. عبر APC ^{مين / +} الفئران مع خط ACTB-ECFP، والذي يعبر ECFP تحت المروج الأكتين، وكذلك مع خط C-FMS-EGFP، الذي يعبر عن EGFP تحت المروج ج-FMS للكشف عن خلايا الدم النخاعي. تستخدم الحيوانات متخالف لACTB-ECFP و C-FMS-EGFP للكشف عن مضان.
2. استخدام الفئران في 3-4 أشهر من العمر لصورة أورام كشف بوضوح.

2. إعداد Mالمقيدين قبل جراحة

ملاحظة: لقد كانت تفاصيل المجهر انشاء سبق وصفها ^6،7.

1. المجهر
   1. بدوره على بطانية التدفئة. بدوره على ليزر الأرجون ل488 نانومتر الإثارة ونانومتر الحالة الصلبة 405، 561 نانومتر، و 640 نانومتر ليزر. بدوره على المجهر، وحدة تحكم القرص الغزل، وAOTF، وحدة التحكم الليزر، وجهاز تحكم الكاميرا.
   2. فتح مصراع المجهر، الأمر الذي يجعل أحمر الصمام. بدوره على برامج الكمبيوتر والكاميرا.
2. منصة التصوير
   1. ضمان إدراج مرحلة نظيف. خلاف ذلك، نظيفة بالصابون والماء ثم تجف.
   2. تأخذ اثنين coverslips واستخدام شريط لمختبر لتأمينها على إدراج. وضع إدراج على المسرح وتنظيفه مع مناديل الكحول.
   3. باستخدام شريط المختبر، نعلق بطانية التدفئة إلى الجانب الأيمن من المسرح.
   4. التحقق من سلامة الحجاب الحاجز المطاطي على مخروط الأنف وتغييره اذا لزم الامرذ. موقف وإصلاح مخروط الأنف تسليم التخدير الأيزوفلورين للحيوان باستخدام الشاش والشريط المختبر.
3. الأيزوفلورين نظام التخدير
   1. إعادة ملء خزان الأيزوفلورين.
   2. بدوره على الفراغ وضبط 1.2 لتر / دقيقة.
   3. إضافة الماء المقطر إلى البخاخات وربط البخاخات لنظام الأيزوفلورين.
   4. تشغيل محلل الأكسجين وتوصيله إلى نظام الأيزوفلورين. تشغيل خزان الأكسجين وضمان محلل الأكسجين يظهر 100٪. ضبط تدفق O ₂ إلى 0.2 لتر / دقيقة.
   5. تشغيل خزان النيتروجين وضبط تدفق في 0.8 لتر / دقيقة. تأكد من أن يظهر محلل الأكسجين 21٪.
4. إعداد أدوات جراحة ومنهاج
   1. نظيفة 2 أزواج من ملقط تشريح ومقص بالماء والصابون.
   2. بدوره على حبة تعقيم الساخن والسماح لها تصل إلى 250 درجة مئوية. تعقيم أدوات الجراحة لمدة 30 ثانية. السماح لهم تهدئة.
   3. وضع معتاد على الثمالة المختبر على مقاعد البدلاء جراحة.
   4. استخدام غطاء الستايروفوم كمنصة الجراحية. تغطية مع قطعة من مختبر معتاد على الثمالة. إعداد القطعة الثانية من مختبر معتاد على الثمالة لتغيير بعد حلق الماوس.
   5. وضع مخروط الأنف مع خط التخدير على غطاء الستايروفوم تغطيتها، وإرفاقه غطاء الستايروفوم (وليس على مختبر معتاد على الثمالة) مع بعض الشريط واستخدام اثنين من الإبر على كلا الجانبين من مخروط الأنف لإبقائها في مكانها.
   6. تجميع بيتادين، مناديل الكحول، شاش معقم، الغراء عظمى، والشرائح المجهر، ماكينة حلاقة كهربائية، و 4 قطع من الشريط المختبر.

3. إعداد الحقن

1. تحت غطاء محرك السيارة، وإعداد حقنة الأنسولين (28 G س ½ في) مع 7 ميكرولتر من الأسهم AF647 مترافق لي-6G (GR1) الأجسام المضادة (1 ملغ / مل) في 100 ميكرولتر من 2،000 كيلو دالتون-رودامين ديكستران (4 ملغ / مل ) للحقن الرجعية المدارية. يوصى حقن الرجعية المداري في ^مين APC ^{/ +} الفئران منذ فقر الدم الذي يتطور في هذه الحيوانات يجعل من difficu أوردة الذيلLT للكشف عن طريق الجلد.
2. تحضير حقنة الأنسولين الثانية مع 1 ملغ / كغ من الأتروبين المخفف في PBS 150 ميكرولتر لتحت الجلد (الشوري) الحقن قبل التصوير لإخماد الحركات تحوي من الأمعاء.

4. إعداد الأمعاء للتصوير

1. تحقق من أن خط التخدير إلى غرفة الاستقراء هو مفتوح، والخطوط إلى طاولة الجراحة والمجهر مغلقة.
2. نقل الحيوان إلى غرفة التخدير. إغلاق غرفة التخدير وبدوره على الأيزوفلورين إلى 4٪ (مع O ₂ 21٪).
3. عندما يتنفس بعمق وببطء الماوس (بعد 5-6 دقيقة)، نقلها إلى مرحلة الجراحية على حدودها وحقن الحل GR1 الأجسام المضادة و / أو حل ديكستران الرجعية orbitally.
4. فتح خط التخدير مرتبطة منصة الجراحية. إغلاق خط إلى غرفة التخدير ووضع الماوس على ظهرها مع أنفها في مخروط التخدير.
5. تقليل الأيزوفلورينالتركيز من 4٪ إلى 2.5٪.
6. تحقق من أن الفأر هو تخدير بشكل جيد من قبل معسر قاطع الطريق، واختبار رد الفعل القرنية.
7. إضافة مرهم التشحيم العيون على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
8. تأمين أطرافه من الماوس لمرحلة الجراحية بإضافة شريط المختبر.
9. إزالة الشعر من السطح البطني باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. أيضا إزالة الشعر من أطرافه هند الأيسر لوضع مقياس التأكسج قبل الاستحواذ. إزالة معتاد على الثمالة المختبر من مرحلة الجراحية واستبدالها بأخرى نظيفة لتجنب التلوث الشعر.
10. تطهير السطح البطني مع مناديل الكحول وبيتادين.
11. حقن محلول الأتروبين (من 3.2) الشوري في الجناح واحدة من الفأرة.
12. جعل 1 سم بطني شق خط الوسط من خلال الجلد والغشاء البريتوني باستخدام مقص وزوج واحد من الملقط. سحب بعناية من 3-4 سم من الأمعاء وتحديد واحد أو عدة أورام في الصورة.
13. اتخاذ ميكر الزجاجالشريحة oscope وموقف حلقة من الأمعاء على ذلك مع وجود ورم في الأعلى.
14. إضافة بعض الغراء عظمى إلى بضعة مواقع على طول الأمعاء ونعلق عليه إلى الشريحة. الانتظار دقيقة واحدة للالغراء لتجف. استخدام علامة لرسم خط على الشريحة مشيرا إلى الورم من أجل تسهيل توطين لها مع متحد البؤر.

5. تحديد المواقع الماوس على مرحلة والتحضير لاكتساب صورة

1. إزالة الشريط المختبر من أطرافه.
2. فتح خط التخدير إلى مرحلة المجهر وإغلاق واحدة إلى منصة الجراحية.
3. نقل الماوس بعناية لمرحلة المجهر مع الجانب البطني إلى أسفل وأنفها في مخروط الأنف. تأمين خط التخدير مع بعض الشريط المختبر.
4. إعادة وضع مؤشر الماوس و / أو الشريحة من أجل الحصول على الأمعاء في قلب واحدة من النوافذ، وتراجع الغطاء. الشريط بلطف إلى أسفل الشريحة مع الشريط المختبر.
5. إرفاق مقياس التأكسج التحقيق إلى الطرف الأيسر من الماوس لاتبع قلبه ومستويات الأوكسجين الشرياني ومعدل التشبع في الجهاز التنفسي.
6. تغطية الماوس مع بطانية التدفئة لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
7. تقليل تركيز الأيزوفلورين من 2.5٪ إلى 1-1.5٪ للتصوير.

6. اقتناء الصور باستخدام البرامج μManager

1. زيادة سرعة CSUX إلى 2،500 دورة في الدقيقة لتحسين جودة الصورة في إعدادات التكوين.
2. استخدم القائمة المنسدلة لاختيار الهدف 10X 20X 0.5 NA أو 0.75 NA Fluar الهدف العدسة.
3. اختيار 405 نانومتر ليزر اللون من القائمة المنسدلة.
4. انقر على لايف وضبط التركيز مع المجهر.
5. انقر على السيارات لضبط القصوى والدنيا كثافة بكسل من الصورة عرض على أساس القيم المتطرفة بكسل في الصورة تلقائيا. ويرد الرسم البياني للكثافة بكسل عرض الصورة في الرسم البياني في الجزء السفلي من النافذة الرئيسية.
6. ضبط التعرض الكاميرا في إطار لوحة التحكم بواسطة بايبرتغيير عدد الساعات (واحد على مدار الساعة هي 33.333 ميللي ثانية).
7. إذا كانت إشارة ساطعة جدا مع أدنى التعرض، وانخفاض كثافة الليزر باستخدام وحدة التحكم المجهر.
8. فحص كثافة إشارة عن 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر خطوط الليزر. ضبط كثافة الليزر مع وحدة الليزر الخاصة التحكم (488 نانومتر و 561 نانومتر) أو وحدة التحكم المجهر.
9. في الإطار متعدد D اكتساب، حدد المربع نقاط الوقت واكتب في عدد من النقاط والوقت الفاصل الزمني المطلوب.
10. ضع علامة في المربع Z-مداخن، اختر "Z النسبي" وتحديد Z-Z البداية والنهاية بالنسبة للموقف الحالي.
    ملاحظة: للحصول على 10X 20X أو هدف، وتبدأ مع 3 طائرات Z، 8 ميكرون أو 4 ميكرون وبصرف النظر التوالي.
11. تحقق مواقف متعددة (XY) مربع لتصوير عدة مواقع، ثم انقر فوق تحرير قائمة الموقف، علامة 4 إلى 6 مواقع مختلفة.
12. ضع علامة في المربع القنوات وإضافة قنوات من جديد وتحديد خطوط ليزر من القائمة المنسدلة والطباعالإلكترونية في التعرض لكل قناة (بمضاعفات 33.333 ميللي ثانية).
13. تحقق حفظ الصور في نافذة "الاستحواذ موضوع D".
14. تحديد مجلد وسيتم حفظ جميع الصور المكتسبة تلقائيا في هذا المجلد مع البادئة اسم معين.
    ملاحظة: سيتم حفظ كل الاستحواذ المستمر في مجلد فرعي منفصل كملفات شجار الفردية لكل شريحة Z في كل لون في كل نقطة زمنية.
15. حفظ جميع الإعدادات بالنقر فوق حفظ الإعدادات في إطار متعدد D اقتناء.
16. انقر اكتساب في الإطار اقتناء متعدد الأبعاد لبدء الاستحواذ.
17. إذا لم يتم استخدام المسبار مقياس التأكسج أو يتوقف عن العمل جيدا (عندما نبض غير مستقر أو الصعب كشف)، والتحقق من كفاءة التخدير كل 15 دقيقة أثناء إجراء التصوير بواسطة معسر قاطع الطريق وفحص منعكس القرنية. ضبط التخدير إذا كان الفأر هو استجابة لهذه المثيرات.
18. بعد الاستحواذ، الموت ببطء الماوس عن طريق زيادة تناسق الأيزوفلورينالتموينية إلى 5٪. عندما لا يتم كشفها حركات التنفس، وإزالة الماوس من مرحلة وإجراء خلع عنق الرحم.

تحليل 7. من الصور باستخدام البرامج Imaris

1. تحويل الملفات إلى .ims (التكميلي الشكل 1A)
   1. فتح برنامج الكاميرا، اضغط على الملف ثم تحويل الدفعة.
   2. انقر على إضافة الملفات واختيار الملف الأول من المركز الأول. كرر لكل موقف.
   3. لكل ملف تم تحميله، انقر على إعدادات وتحقق من أن إعدادات "تي" للمرة "ج" للقنوات و "Z" لZ-مداخن تظهر في هذا النظام.
   4. حفظ في المجلد المطلوب. تصفح وإنشاء ملف جديد وتحويلها.
   5. انقر على مجموعة للجميع وابدأ.
2. تعديلات (التكميلية الشكل 1B)
   1. اذهب إلى مجلد معين وتحويله فتح الملف الأول.
   2. عرض في نافذة التعديل، وضبط الخلفيةإشارة قطع طريق تعديل عدد الحد الأدنى لكل قناة إذا لزم الأمر.
   3. إذا لزم الأمر، وضبط كثافة إشارة عن طريق تعديل عدد ماكس (ماكس وانخفاض عدد، وارتفاع كثافة إشارة).
      ملاحظة: تعديلات للإشارة الكثافة / التباين تمكن من تسليط الضوء على سلوك الخلية أو حجرة من أجل أن يكون لها تصور أجمل. لا يغير النتيجة نفسها.
   4. انقر على تحرير وصورة خصائص.
   5. تغيير X، Y، Z والقيم (ل10X الهدف، x و y = 0.712، ض = 8 ميكرون، ل20X الهدف: x و y = 0.36، ع = 4 ميكرومتر).
   6. انقر على كل مسافة واحدة لضبط نقاط زمنية. إضافة تاريخ البدء ووقت البدء في عملية الاستحواذ. إضافة نهاية التاريخ ونهاية الوقت اكتساب (التكميلي الشكل 1C).
   7. انقر على زر التشغيل لمشاهدة الفيلم.
   8. انقر فوق تحرير وحذف نقاط زمنية لحذف الصور الباهتة.
   9. للانضمام عمليتي استحواذ منفصلة توجيذر في فيلم واحد، انتقل إلى نقطة زمنية الأخيرة من الفيلم الأول وانقر على تحرير> إضافة نقاط الوقت لإضافة الملف الثاني.
3. إنقاذ كفيلم (التكميلي 1D الشكل)
   1. انقر على سجل، واختيار وسائل التحقق التمديد وعامل ضغط من 0.
   2. انقر على حفظ.

Representative Results

باستخدام الغزل القرص المجهري متحد البؤر والأنسجة غير ورمي ورمي في والأمعاء الدقيقة من APC ^{مين / +،} ACTB-ECFP، الفئران C-FMS-ECFP يمكن تصور من السطح المصلي. بعد التصوير، يتم استخدام برنامج الكاميرا لتحليل وضبط اكتساب (الشكل التكميلي 1). بعد الوريدي (IV) حقن الفلورسنت 2،000 كيلو دالتون ديكستران رودامين، ولي-6G 647 الأجسام المضادة مترافق والأوعية الدموية وPMNs يمكن الكشف على التوالي (الشكل 1). بقع باير التي هي تجمعات من الأنسجة اللمفاوية وكامل من خلايا الدم النخاعي يمكن رؤيتها بسهولة (الشكل 1A). ويحيط الخبايا من الأمعاء الدقيقة بواسطة الأوعية الدموية وخلايا الدم النخاعي (الشكل 1A و 1B). الأنسجة ورمي في كثير من الأحيان أكثر وأكثر أوعية دموية تسللت من خلايا الدم النخاعي، وهيكل الخبايا أقل ث نظمت الذراع (الشكل 1A و 1B) اعتمادا على حجم الورم. يمكن أن يتم الاستحواذ باستخدام 10X 0.5 NA (الشكل 1A) وعدسات 20X 0.75 NA Fluar (الشكل 1B) ولكننا حصلنا على أفضل أداء مع 10X 0.5 NA Fluar العدسة التي كانت مشرقة، والسماح للالاستحواذ على منطقة كبيرة (676 س 676 ميكرون)، ويمكن أن توفر الصور من ما يصل الى 70 ميكرون في الأنسجة. على نحو سلس طبقة العضلات معربا عن الأكتين-ECFP يمكن في بعض الأحيان تجعل التركيز على ظهارة الأمعاء الصعب (الشكل 1B، اللوحة اليمنى). يمكن اتباعها خلايا ديناميات الدم النخاعي في الأورام في الوقت الحقيقي لبضع ساعات كما هو مبين في الشكل المتحركة / فيديو 2. حين العدلات (GR1 خلايا +) تدور في الأوعية الدموية وتقوم بدوريات في أنسجة وخلايا الدم النخاعي أخرى، معظمها الضامة، تحيط الخبايا وأقل متحركة (صور / فيديو الشكل 2).

ن الصفحة = "دائما">
الرقم 1. الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها مع الغزل مبائر القرص من الأنسجة غير ورمي ورمي من وAPC ^{مين / +} الفئران. (A) صور أربعة ألوان (10X Fluar، 0.5 NA عدسة) من ظهارة الأمعاء الصغيرة من سطح المصلي من APC ^{مين / +،} ACTB-ECFP، cfms-EGFP الماوس التي تلقت الرابع الفلورسنت 2،000 كيلو دالتون ديكستران-رودامين (أحمر) ولي-6G 647 الأجسام المضادة مترافق (أبيض). تظهر اللوحة اليسرى ظهارة غير ورمي وتظهر اللوحة اليمنى ورم من نفس APC ^{مين / +،} ACTB-ECFP، cfms-EGFP الماوس. خلايا الدم النخاعي هي الخضراء والزرقاء هي الخلايا الظهارية. وينظر الى مجموعة من C-FMS + الخلايا في الأنسجة المعوية غير ورمي في التصحيح وباير (السهم الأبيض)، شريط النطاق = 100 ميكرومتر (B) صور أربعة ألوان (20X Fluar، 0.5 NAعدسة) من ظهارة الأمعاء الصغيرة من سطح المصلي من APC ^{مين / +،} ACTB-ECFP، cfms-EGFP الورم. في اللوحة اليمنى، تم الكشف عن عدة نقرا مزدوجا إيجابية GR1 ⁺ ج ⁺ FMS الخلايا في الأنسجة ورمي. وتظهر اللوحة اليمنى صورة للطبقة العضلات الملساء معربا عن الأكتين-ECFP التي يمكن أن تجعل التركيز على ظهارة الأمعاء الصعبة، شريط النطاق = 50 ميكرومتر.

المتحركة / فيديو الشكل 2 . ديناميات خلية الدم النخاعي في 3 ملم غدي من APC ^{مين / +} الماوس. أربعة لون الوقت الفاصل بين ظهارة الأمعاء الدقيقة (10X Fluar، 0.5 NA العدسة) من سطح المصلي من APC ^{مين / +} ، ACTB-ECFP، cfms-EGFP الماوس شارك في حقن الفلورسنت 2،000 كيلو دالتون ديكستران-رودامين (أحمر) ولي-6G 647 الأجسام المضادة مترافق (أبيض). خلايا الدم النخاعي هي الخضراء والخلايا الظهارية زرقاء. خلايا الدم النخاعي حول الخبايا لا تتحرك. بعض العدلات (خلايا GR1 + بيضاء) تقوم بدوريات في الأنسجة. هذا هو اكتساب 2 ساعة، وقد اسرعت الفيلم حتى 295 مرة.

الشكل التكميلي 1 . قطات الشاشة من برنامج الكاميرا لتحليل الاستحواذ. (A) أولا، تحتاج الملفات المراد تحويلها إلى .ims التمديد. (B) ثم عرض الصور يمكن تعديلها، مثل إشارات محددة يمكن زيادة وانخفض الخلفية (C) تاريخ وتحتاج وقتا لتعديلها من أجل الحصول على الفيلم في الوقت الحقيقي. يمكن انقاذه (D) اكتساب كفيلم.

Discussion

في هذه الورقة، يتم وصف بروتوكول مفصل عن الغزل القرص التصوير متحد البؤر ديناميات خلية الدم النخاعي في الأورام المعوية لعدة ساعات في الحيوانات الحية، التقط من الجانب المصلي للأمعاء.

لتجنب الالتهاب وأن الظروف الفسيولوجية الأمثل، والتصوير من الأمعاء الذي ينبغي القيام به على الجهاز سليمة. ومع ذلك، والتصوير من الجانب المصلي من الأمعاء هو أمر صعب، لأن ضوء أن يذهب من خلال طبقات الأنسجة المختلفة مثل العضلات الملساء قبل الوصول إلى ظهارة. يمكن التركيز على ظهارة يكون من الصعب في بعض المناطق، ولا سيما في الأكتين-ECFP مراسل الفئران منذ يتم التعبير عن غاية الأكتين من قبل خلايا العضلات الملساء. على الرغم من أن اثنين من الفوتون المجهري لديه مصلحة اختراق الأنسجة أعمق بالمقارنة مع المجاهر مبائر، وجدنا أن المجهر الغزل القرص مبائر من القوة ما يكفي للحصول على التصور الجيد للبنية الظهارية في الأمعاء. مزايا سو الغزل القرص المجهري تشمل القدرة على اكتساب سريع جدا وحساسية فريدة دون التضحية قرار متحد البؤر. هذه الصفات تسمح مراقبة العمليات الحيوية حتى لو كان المراد حذفه بسبب التحف حركة بعض النقاط لها الوقت، تقليل photodamage، وتمكن من التصوير من الجزيئات ضعيفة نسبيا الفلورسنت.

التصوير الأمعاء من الجانب المصلي يمكن أيضا أن يكون تحديا بسبب الحركات تحوي الذاتية لهذا الجهاز. في هذا البروتوكول، ويتم إعطاء حقن الشوري من الأتروبين قبل التصوير، ويقلل من كفاءة الحركة. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن حركة تحوي أكثر واسعة في الأمعاء الغليظة، ولكن لم يتم تثبيط جيدا عن طريق العلاج الأتروبين، مما يجعل التصوير صعبا للغاية في هذا الجزء من القناة الهضمية. طبقة العضلات الملساء في القولون هو إلى حد ما أكثر بروزا ج ompared إلى الأمعاء الدقيقة ويبدو أن أكثر مقلص. لذلك،يكاد يكون من المستحيل التركيز على ظهارة في الفئران مراسل الأكتين-ECFP. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى هذه الحركات الذاتية، يمكن أن يحدث الانجراف الجهاز، ولكن في هذه الحالة تصحيح الانحراف الخلفي يمكن أن يؤديها باستخدام برنامج الكاميرا.

آخر تحديا كبيرا في تجارب التصوير الغازية هو الحفاظ على الماوس على قيد الحياة وبصحة جيدة لأطول وقت ممكن تحت التخدير. يتم الوصول إلى الأمعاء عن طريق فتح التجويف البريتوني. وبالتالي فإن الإجراء هو أكثر الغازية من تلك المستخدمة للتصوير ورم الثدي، الذي يمكن القيام به لمدة تصل إلى 40 ساعة بسبب سلامة الصفاق. كان أقصى اكتساب القيام به مع التجويف البريتوني فتح 6 ساعة، ولكن الفأر كان لا يزال على قيد الحياة مع عدم وجود علامات واضحة الشدة، وذلك حتى اكتساب أطول قد يكون ممكنا.

في هذه الدراسة النخاعي يمكن اتباعها سلوك الخلية وتحليلها داخل الورم الأمعاء باستخدام الفئران مراسل الفلورسنت وأيضا تألقي مترافق رالمتسابقين أو الأجسام المضادة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج لرصد أنواع الخلايا الأخرى مثل Tregs، والخلايا الجذعية أو الخلايا الليفية باستخدام Foxp3-EGFP أو CD11c و-DTR-EGFP، أو Fsp1-EGFP الفئران مراسل التوالي، كما تم استخدامها في الدراسة الورم الثديية ⁶ . أيضا، والأجسام المضادة الفلورسنت ضد السكان الخلية غير العدلات يمكن حقن الرابع وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تحليل سلوك الخلية في ظروف مختلفة، مثل نقص الأكسجة. مثل هذه التجارب قد يعطي رؤى جديدة في سلوك تلك الخلايا سدى بعد العلاج مع العلاج الكيميائي أو العلاج المستهدف. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن استخدامها في نماذج الماوس أخرى من السرطان والأمعاء في مراحل مختلفة من تطور الورم. APC ^{مين / +} الفئران تتطور البوليبات الغدية المعوية فقط، والذي لا يتطور إلى خبيثة لأن الفئران لها عمر تقصير. سيكون من المثير للاهتمام أن دراسة ديناميكية خلايا الدم النخاعي في غيرها من نماذج سرطان الأمعاء مع المزيد من AGGالأورام ressive والغازية مثل الفئران تحمل طفرات في K-راس ^19-21 أو ²² Smad4 الجينات بالإضافة إلى الطفرة APC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ApcMin/+ mice	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
Nitrogen	UCSF
Oxygen	UCSF
1x PBS	UCSF cell culture facility
Saline Buffer	UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse
Atropine	LARC UCSF		Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes	Becton Dickinson	326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe	Becton Dickinson	329465
Remium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5M	24x50-1
Betadine	LARC UCSF
Heat blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch	Electron Microscopy Sciences	72310-10
Anesthesia system	Summit Anesthesia Support
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
Stage insert	Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit Anesthesia Support
Imaris	Bitplane
μManager	Vale lab, UCSF		Open-source software
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b