Kvantitativ immunofluorescensassay at måle variationen i proteinniveauer på centrosomer
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
Centrosomer er små, men vigtige organeller, der tjener som poler mitosespindelen at opretholde genomisk integritet eller samle primære cilier at lette sensoriske funktioner i celler. Niveauet af et protein kan reguleres forskelligt på centrosomer end på andre .cellular steder, og variationen i centrosomal niveau af flere proteiner på forskellige punkter af cellecyklus synes at være afgørende for en korrekt regulering af centriole forsamling. Vi udviklede en kvantitativ fluorescensmikroskopi assay, der måler de relative ændringer i niveauet af et protein ved centrosomer i fikserede celler fra forskellige prøver, såsom i de forskellige faser af cellecyklus eller efter behandling med forskellige reagenser. Princippet i dette assay ligger i måling korrigeret for baggrund fluorescensintensitet svarende til et protein på et lille område, og normalisere denne måling mod det samme for et andet protein, der ikke varierer i henhold til den valgte eksperimentelle cetingelse. Ved hjælp af dette assay i kombination med BrdU puls og chase strategi at studere uforstyrrede cellecykler har vi kvantitativt valideret vores nylige iagttagelse, at centrosomal pulje af VDAC3 reguleres på centrosomer under cellecyklussen, sandsynligvis ved proteasom-medieret nedbrydning specifikt mod centrosomer.
Introduction
Centrosomer består af et par centrioler omgivet af pericentriolar materiale (PCM). At være de store mikrotubuli organisere centre (MTOCs) i pattedyrceller, centrosomer tjene som de to poler af mitotiske spindler i delende celler, og dermed bidrage til at bevare genomisk integritet 1. I hvilende celler (f.eks under G0 fase), en af de to centrioler af centrosom, nemlig moderen centriole, omdannes til en basal organ til at samle den primære cilium, en sensorisk organel rager ud fra celleoverfladen 2. Når cellerne igen ind i cellecyklen, er primære cilier adskilt og hver centriole dirigerer samling af en procentriole ved sin proximale ende, som gradvis elongates at danne et modent centriole 3. Ved indtræden af S-fase, er en cartwheel-lignende struktur, der giver 9-fold symmetri til centriole dannet på overfladen af hver eksisterende centriole og bliver bunden af hver procentriole. Sas6 that er uundværlig for centriole samling ansættes til at danne centrum for vejrmølle 4-6. Andre centriolar proteiner samles derefter på vejrmølle i et stærkt reguleret, proksimal til distal måde 7. Efter netop at udfylde centriole dobbeltarbejde, celler samle yderligere pericentriolar materialer til at bygge to funktionelle centrosomer ved udgangen af G2 fase 8. Ud over de centrale centriolar komponenter 9-11 flere andre proteiner, herunder kinaser, phosphataser, chaperoner, stillads komponenter, membran associerede proteiner og nedbrydning maskiner er forbundet med centrioler basal organer og PCM på forskellige tidspunkter af cellecyklussen 12-16. Det er ofte bemærkes, at de centrosomal niveauer af mange proteiner tidsmæssigt er reguleret af centrosomal målretning mekanismer og / eller proteasomalaktivitet nedbrydning ved centrosomer. Vigtigt er det, udsvingene i centrosomal niveau af flere proteiner såsom Plk4, Mps1, Sas6 og CP110 ent forskellige punkter af cellecyklus synes at være afgørende for at regulere centriole samling 5,17-22, og i tilfælde af Mps1 forhindre denne centrosomal nedbrydning fører til dannelse af overskydende centrioler 19. På den anden side centrosomal fraktioner af adskillige proteiner er mindre labile i forhold til cytosoliske pools. For eksempel siRNA-medieret nedregulering af Centrin 2 (Cetn2) medførte kun en moderat fald i proteinniveauet på centrioler trods stor nedgang i hele dets celleniveauer 23. Det er derfor afgørende at måle ændringer i niveauet af centrosomal proteiner på centrosom stedet måle hele celle protein niveauer, når de vurderer deres centrosom-specifikke funktioner.
I denne undersøgelse har vi udviklet et assay ved indirekte immunofluorescens (IIF) at kvantificere det relative niveau af et protein på centrosomer. Dette assay er udviklet specielt til at analysere celler, som er fra forskellige prøverog kan derfor ikke afbildes samtidigt. Disse prøver kan være celler, som blev behandlet med forskellige reagenser (dvs. lægemiddel versus kontrol), opsamlet på forskellige tidspunkter (dvs. puls versus chase), eller befinder sig i forskellige faser af cellecyklussen. Princippet i dette assay ligger i måling korrigeret for baggrund fluorescensintensitet svarende til et protein på et lille område, og at normalisere denne værdi mod den samme for et andet protein, hvis niveauer ikke varierer under de valgte forsøgsbetingelser. Adskillige undersøgelser i centrosom biologi har for nylig udnyttet forskellige kvantitative mikroskopiteknikker, både levende og fikserede celler at bestemme centrosom-specifikke funktion af kandidat-proteiner 24-27. Svarende til disse assays den foreliggende teknik måler også korrigeret for baggrund fluorescensintensitet af testproteinet. Imidlertid ville inddragelsen af normaliseringen anvendes en intern standard i denne analyse sandsynligvis give størrenøjagtighed og tillid i at analysere to forskellige prøver, der er på to forskellige dækglas. Endvidere, ud over at undersøge proteinniveauet ved centrosomer, med mindre justeringer denne metode kan anvendes til et bredt sæt af eksperimentelle betingelser eller andre cellulære steder.
Her kombinerer vi vores kvantitative mikroskopi assay med en BrdU puls-chase strategi for at sammenligne celler fra forskellige cellecyklus. I stedet for at bruge standard cellecyklusstandsning og frigivelse teknikker til at undersøge forskellige cellecyklus tidspunkter asynkront voksende celler inkuberes med BrdU at mærke celler i S-fase, og de mærkede celler jages til forskellige tidspunkter (typisk 4-6 timer). De fleste af de mærkede celler vil være i S-fasen umiddelbart efter impulsen. Længden af chase vælges således, at efter chase vil mærkede celler i slutningen S, G2 eller mitose, hvilket kan verificeres ved morfologiske karakteristika såsom-stilling af centrosomer med hensyn til nucLei, afstanden mellem centrosomer, kondensering af kromosomer osv Således længden af chase afhænger af den gennemsnitlige varighed af S, G2 og M fase af en særlig celletype. Da denne fremgangsmåde undgår cellecyklusinhibitorer såsom hydroxyurinstof, aphidicolin, nocodazol osv, det giver en mere fysiologisk relevant cellecyklusanalyse.
Således viser vi her, at den kvantitative fluorescens mikroskopi analyse alene, eller i kombination med BrdU puls-chase assay, er en simpel endnu kraftfulde teknik til at præcist at måle de relative ændringer i centrosomal niveau af et kandidat-protein under en uperturberede cellecyklus. Vi målte centrosomal niveau VDAC3, et protein, som vi for nylig identificeret på centrosomer foruden mitokondrier 16,28 ved hjælp af disse assays. Resultater opnået her kontrollere vores tidligere bemærkning om, at centrosomal pulje af VDAC3 reguleres af nedbrydning, og varierer også i en celle cyklus dependent måde 16 endvidere validering af anvendeligheden af denne metode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantitativ mikroskopi i cellebiologi er ofte forbundet med levende cell imaging assays, såsom fluorescensresonansenergioverførsel (FRET), Fluorescens Recovery Efter Fotoblegning (FRAP) osv Men der er voksende eksempler på cellebiologer udvikle forskellige kvantitative mikroskopi analyser for fast celler i de seneste år 27,34-36. Det er vigtigt, fremskridt i forståelsen centrosom biologi ofte kræver forståelse af centrosom-specifikke funktion proteiner, hvis centrosomal puljer kan være regule…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
