Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Centrosomes sont petits mais importants organites qui servent de pôles de fuseau mitotique pour maintenir l'intégrité génomique ou assembler les cils primaires pour faciliter les fonctions sensorielles dans les cellules. Le niveau d'une protéine peut être réglé différemment au centrosome que dans d'autres endroits .cellular, et la variation du niveau centrosomale de plusieurs protéines à différents points du cycle cellulaire semble être crucial pour le bon régulation de l'assemblage centriole. Nous avons développé un dosage quantitatif microscopie fluorescence qui mesure les changements relatifs dans le taux d'une protéine dans des centrosomes dans des cellules fixées provenant de différents échantillons, comme à différentes phases du cycle cellulaire ou après le traitement avec divers réactifs. Le principe de ce test réside dans la mesure de l'intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région, et qui normalise la même mesure par rapport à une autre protéine qui ne varie pas dans le cadre du c expérimental choisiondition. Utilisant cet essai en combinaison avec impulsion de BrdU et la stratégie de la chasse à étudier cycles cellulaires non perturbés, nous avons quantitativement validé notre récente observation que la piscine centrosomale de VDAC3 est réglementée au centrosomes au cours du cycle cellulaire, vraisemblablement par la dégradation par le protéasome spécifiquement au centrosome.

Introduction

Centrosomes sont constitués d'une paire de centrioles entourées par un matériau péricentriolaire (PCM). Étant les principaux centres d'organisation des microtubules (de MTOCs) dans les cellules de mammifères, centrosomes servent les deux pôles de fuseau mitotique dans les cellules en division, et contribuent ainsi à maintenir l'intégrité du génome ^1. Dans les cellules au repos (par exemple, pendant la phase G0), l'un des deux centrioles du centrosome, à savoir le centriole mère, est transformé en un corps de base pour assembler le cil primaire, un organite sensoriel faisant saillie de la surface de la cellule ^2. Une fois les cellules re-entrer dans le cycle cellulaire, les cils primaires sont démonté et chaque centriole dirige l'assemblage d'un procentriole à son extrémité proximale qui se allonge progressivement pour former un centriole maturité ^3. Au début de la phase S, une structure de roue en forme qui assure la symétrie neuf fois au centriole est formée sur la surface de chaque centriole existant et deviendra la base de chaque procentriole. SAS6 tchapeau est indispensable pour l'assemblage de centriole est recruté pour former le moyeu de la roue ^4-6. D'autres protéines centriolaires sont ensuite assemblés sur la roue dans un très réglementé, de manière proximale à distale ^7. Après avoir terminé précisément duplication centriole, les cellules se assemblent matériaux péricentriolaire supplémentaires pour construire deux centrosomes fonctionnels d'ici la fin de la phase G2 ^8. En plus des composants principaux centriolaires ^9-11, plusieurs autres protéines kinases, y compris, les phosphatases, chaperons, des composants d'échafaudage, protéines associées à membrane et des machines de dégradation sont associés à des centrioles, les organismes de base et PCM à différents moments du cycle cellulaire ^12-16. Il est souvent noté que les niveaux centrosomales de nombreuses protéines sont temporellement régulées par des mécanismes de ciblage centrosomales et / ou dégradation par le protéasome au centrosome. Fait important, les fluctuations du niveau centrosomale de plusieurs protéines telles que PLK4, Mps1, SAS6, et un CP110t différents points du cycle cellulaire semble être cruciale pour réguler ensemble de centriole ^5,17-22, et dans le cas de Mps1 empêcher cette dégradation centrosomale conduit à la formation d'excès centrioles ^19. D'autre part, les fractions centrosomales de plusieurs protéines sont moins labiles par rapport aux piscines cytosoliques. Par exemple siRNA médiée par régulation à la baisse de Centrin 2 (Cetn2) ne conduit à une diminution modérée de la teneur en protéines dans les centrioles malgré une grande réduction dans les niveaux de cellules entières ^23. Il est donc crucial pour mesurer les changements dans le niveau de protéines centrosomales au centrosome plutôt que de mesurer l'ensemble des niveaux de protéines de la cellule lors de l'évaluation de leurs fonctions spécifiques centrosome.

Dans cette étude, nous avons développé un test par immunofluorescence indirecte (IFI) pour quantifier le niveau relatif d'une protéine au centrosome. Cet essai a été développé en particulier pour analyser les cellules qui sont de différents échantillonset ainsi ne peut pas être imagée en même temps. Ces échantillons peuvent être des cellules qui ont été traitées avec différents réactifs (ce est à dire, un médicament par rapport au témoin), recueillies à différents points dans le temps (ce est à dire, le pouls contre la chasse), ou sont dans différentes phases du cycle cellulaire. Le principe de ce test réside dans la mesure de l'intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région et pour normaliser la valeur contre le même pour une autre protéine dont le niveau ne varie pas dans les conditions expérimentales choisies. Plusieurs études de la biologie des centrosomes ont récemment utilisé diverses techniques de microscopie quantitative, dans les deux cellules vivantes ou fixées, afin de déterminer la fonction spécifique du centrosome de protéines candidates ^24-27. Similaires à ceux des essais, la présente technique mesure aussi l'arrière-plan corrigé intensité de fluorescence de la protéine d'essai. Toutefois, l'inclusion de la normalisation en utilisant un standard interne dans cet essai aurait probablement offrir une plus grandela précision et la confiance dans l'analyse de deux échantillons différents qui sont sur deux lamelles différentes. En outre, en plus de l'examen de la protéine au niveau de centrosomes, avec des ajustements mineurs ce procédé peut être appliqué à un ensemble diversifié de conditions expérimentales ou à d'autres sites cellulaires.

Ici, nous combinons notre analyse quantitative de microscopie avec une stratégie pulse-chase BrdU de comparer les cellules à différents stades du cycle cellulaire. Au lieu d'utiliser des techniques d'arrêt du cycle cellulaire standard et libération d'étudier divers moments du cycle cellulaire, les cellules en croissance de manière asynchrone sont incubées avec BrdU pour marquer les cellules en phase S, et les cellules marquées sont chassés pendant divers temps (typiquement 4-6 heures). La plupart des cellules marquées seront en phase S immédiatement après l'impulsion. La longueur de la chasse est choisi de manière que, après la chasse, cellules marquées seront à la fin de S, G2, ou mitose, qui peut être vérifié par des caractéristiques morphologiques telles de position as- du centrosome par rapport à nuclei, la distance entre les centrosomes, la condensation des chromosomes, etc. Ainsi, la longueur de la chasse dépend de la durée moyenne de S, G2 et M phase d'un type cellulaire particulier. Étant donné que cette approche évite les inhibiteurs du cycle cellulaire tels que l'hydroxyurée, l'aphidicoline, nocodazole, etc., il permet une analyse plus physiologiquement pertinente du cycle cellulaire.

Ainsi, nous démontrons ici que le dosage quantitatif de la microscopie par fluorescence seul, ou en combinaison avec BrdU test pulse-chase, est une technique simple mais puissant pour mesurer avec précision les changements relatifs dans le niveau centrosomale d'une protéine de candidat pendant une cycle cellulaire imperturbable. Nous avons mesuré le niveau de centrosomale VDAC3, une protéine que nous avons récemment identifié au centrosomes en plus de mitochondries ^16,28, l'utilisation de ces tests. Les résultats obtenus ici vérifier notre observation précédente que la piscine centrosomale de VDAC3 est régulée par la dégradation, et varie également en un dependen du cycle cellulairet ¹⁶ manière, la validation outre l'applicabilité de cette méthode.

Protocol

1. Culture cellulaire Utilisez télomérase humaine transcriptase inverse (hTERT) cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine immortalisées (hTERT-RPE1; appelle ici RPE1). REMARQUE: les cellules sont des cellules humaines RPE1 quasi-diploïdes, non transformées qui sont couramment utilisés pour étudier ensemble centriole et ciliogenèse. Ces cellules suivent un cycle de duplication normale centriole coordonné avec un cycle cellulaire régulée. Passage d'une boîte de 10…

Representative Results

Nos études récentes ont identifié roman localisation centrosomale et la fonction de VDAC3, l'un des porines mitochondriales 16,28. Immunocoloration de plusieurs cellules de mammifères y compris les cellules RPE1 utilisant un anticorps spécifique VDAC3 a présenté une coloration centrosomale proéminent et relativement faible coloration mitochondriale. Nous avons également montré que VDAC3 centrosomale est préférentiellement associée à la centriole mère, et la piscine centrosomale à la fois e…

Discussion

La microscopie quantitative en biologie cellulaire est souvent associée à des tests d'imagerie cellules vivantes telles que Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), etc. Cependant, il ya des exemples croissants de biologistes cellulaires développement différents tests de microscopie quantitative pour fixe cellules au cours des dernières années ^27,34-36. Fait important, les progrès dans la compréhension de la biologie cen…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter