Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Centrossomas são pequenas, mas importantes organelas que servem como os pólos do fuso mitótico para manter a integridade genômica ou montar cílios para facilitar funções sensoriais nas células. O nível de uma proteína pode ser regulado de forma diferente em centrossomas do que em outros locais .cellular, e a variação no nível centrosomal de várias proteínas em diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para a regulação correcta da montagem centriole. Foi desenvolvido um ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa que mede as mudanças relativas no nível de uma proteína na centrossomas em células fixadas a partir de diferentes amostras, tais como em diferentes fases do ciclo celular, ou após tratamento com vários reagentes. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma pequena região, e que normalizar medição contra o mesmo para uma outra proteína que não varia no âmbito do c experimental escolhidoondition. Utilizando este ensaio, em combinação com BrdU de pulso e caça estratégia para estudar os ciclos celulares não perturbados, temos quantitativamente validado nossa observação recente de que o conjunto de centrosomal VDAC3 é regulada a centrossomas durante o ciclo celular, provavelmente pela degradação mediada por proteassoma especificamente em centrossomas.

Introduction

Centrossomas consistem em um par de centríolos cercados por material de pericentriolar (PCM). Sendo os principais centros de microtúbulos organizadoras (MTOCs) em células de mamíferos, centrosomes servem como os dois pólos de fusos mitóticos em células em divisão, e, assim, ajudar a manter a integridade genômica ^1. Em células quiescentes (por exemplo, durante a fase G0), um dos dois centrioles do centrossoma, a saber, a centriole mãe, é transformado em um corpo de base, ao montar o cílio primário, um organelo sensorial salientes para fora a partir da superfície de células ^2. Uma vez que as células re-entrar no ciclo celular, os cílios são desmontados e cada centriole dirige a montagem de um procentriole na sua extremidade proximal que, gradualmente, se alonga para formar um centriole ³ madura. No início da fase S, uma estrutura semelhante a cambalhota que fornece a simetria de 9 vezes para a centriole é formada sobre a superfície de cada centriole existente e irá tornar-se a base de cada procentriole. SAS6 tchapéu é indispensável para a montagem centríolo é recrutado para formar o cubo da roda de carroça ^4-6. Outras proteínas centriolar são então montados para a cambalhota em um ambiente altamente regulado, proximal para distal maneira ^7. Depois de completar precisamente duplicação centríolo, células montar materiais pericentriolar adicionais para construir dois centrossomas funcionais até o final da fase G2 ^8. Em adição aos componentes principais centriolar ^9-11, várias outras proteínas, incluindo cinases, fosfatases, chaperones, componentes de andaime, proteínas de membrana associadas a degradação e máquinas estão associados com centrioles, corpos basais e PCM em alturas diferentes do ciclo celular ^12-16. Ele é frequentemente observado que os níveis de centrosomal muitas proteínas são temporalmente regulados por mecanismos de segmentação centrosomal e / ou degradação no proteossómica centrossomas. É importante ressaltar que as flutuações no nível centrosomal de várias proteínas, como Plk4, MPS1, SAS6 e CP110 umt diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para regular montagem centriole ^5,17-22, e no caso de MPS1 prevenir essa degradação centrosomal leva à formação de um excesso de ¹⁹ centrioles. Por outro lado, as fracções centrosomal de várias proteínas são menos lábeis em relação a piscinas citosólicas. Por exemplo siRNA mediada down-regulação da Centrin 2 (Cetn2) levou a apenas uma diminuição moderada do nível de proteína nas centrioles apesar de grande redução em toda a sua níveis de células ^23. É, portanto, essencial para medir as mudanças no nível de proteínas centrosomal no centrosome em vez de medir os níveis de proteínas inteiras celular ao avaliar suas funções específicas do centrossoma.

Neste estudo foi desenvolvido um ensaio utilizando imunofluorescência indireta (IFI) para quantificar o nível relativo de uma proteína no centrosomes. Este ensaio é desenvolvido particularmente para analisar as células que são a partir de diferentes amostrase, portanto, não pode ser trabalhada ao mesmo tempo. Estas amostras podem ser células que foram tratadas com diferentes reagentes (isto é, a droga versus controlo), recolhidas a diferentes pontos de tempo (isto é, contra perseguição de impulso), ou estão em diferentes fases do ciclo celular. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma região pequena e para normalizar o valor contra o mesmo para uma outra proteína cujos níveis não variam de acordo com as condições experimentais escolhidas. Vários estudos em biologia do centrossoma recentemente utilizados várias técnicas de microscopia quantitativa, em ambas as células vivas ou fixadas, para determinar a função específica do centrossoma de proteínas candidatas ^24-27. Semelhante aos ensaios, a presente técnica também mede a intensidade de fluorescência de fundo corrigido da proteína a testar. No entanto, a inclusão da normalização utilizando um padrão interno no presente ensaio seria provável oferecer maiorprecisão e confiança na análise de duas amostras diferentes que estão em duas lamelas diferentes. Além disso, em adição ao exame do nível de proteína no centrossomas, com pequenos ajustes este método pode ser aplicado a um conjunto diversificado de condições experimentais ou em outros locais celulares.

Aqui, nós combinamos nosso ensaio microscopia quantitativa, com uma estratégia de pulso-chase BrdU para comparar as células de diferentes fases do ciclo celular. Em vez de utilizar técnicas de paragem do ciclo celular e padrão de libertação para o estudo de vários pontos de tempo do ciclo celular, as células que crescem de forma assíncrona são incubadas com BrdU para marcar as células em fase S, e as células marcadas são perseguidos durante vários tempos (tipicamente 4-6 h). A maioria das células marcadas estará em fase S imediatamente após o pulso. O comprimento da perseguição é escolhida de modo que após a perseguição, células marcadas será no final de S, G2 ou mitose, o que pode ser verificado por características morfológicas, tais como- posição de centrossomas no que diz respeito ao nuclei, a distância entre os centrossomas, condensação de cromossomas, etc. Assim, o comprimento da perseguição depende da duração média de S, G2 e M de fase num tipo de célula particular. Uma vez que esta abordagem evita a inibidores do ciclo celular, tais como a hidroxiureia, a afidicolina, nocodazol, etc, que permite uma análise mais fisiologicamente relevante do ciclo celular.

Assim, demonstramos aqui que o ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa sozinho, ou em combinação com BrdU de pulso-caça ensaio, é uma técnica simples e poderosa para medir com precisão as mudanças relativas no nível centrosomal de uma proteína candidata durante um ciclo celular perturbado. Foi medido o nível de centrosomal VDAC3, uma proteína que, recentemente identificado em centrossomas além de mitocôndrias ^16,28, utilizando estes ensaios. Os resultados obtidos aqui verificar a nossa observação anterior de que a piscina centrosomal de VDAC3 é regulada pela degradação, e também varia em um dependen ciclo celulart modo ^16, além disso validando a aplicabilidade deste método.

Protocol

1. Cultura celular Use telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) nas células epiteliais pigmentares da retina imortalizadas (hTERT-RPE1; referido aqui como RPE1). NOTA: células RPE1 são células humanas quase diplóides, não transformadas que são comumente usados ​​para estudar a montagem centríolo e ciliogênese. Estas células seguem um ciclo de duplicação centríolo normais coordenado com um ciclo celular regulamentado. Uma passagem quase confluentes 100 milímetros prato…

Representative Results

Os nossos estudos recentes identificaram novos centrosomal localização e função de VDAC3, uma das porinas mitocondriais 16,28. A imunocoloração de várias células de mamíferos, incluindo células RPE1 utilizando um anticorpo específico VDAC3-centrosomal apresentaram coloração proeminente e coloração mitocondrial comparativamente fraca. Nós também mostrou que VDAC3 centrosomal é preferencialmente associado ao centríolo mãe, ea piscina centrosomal tanto da endógeno e ectopically expressa VDAC…

Discussion

Microscopia quantitativa em biologia celular é comumente associado com ensaios de imagem em células vivas, como a fluorescência de Ressonância Energia Transferência (FRET), Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP), etc. No entanto, há exemplos de crescimento de biólogos celulares em desenvolvimento diferentes ensaios de microscopia quantitativos para fixo células nos últimos anos ^27,34-36. É importante ressaltar que o progresso na compreensão da biologia centrosome mui…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter