Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
Sentrozomlar genomik bütünlüğünü korumak veya hücrelerde duyusal işlevleri kolaylaştırmak için birincil kirpikler araya mitotik iğ direkleri olarak hizmet küçük ama önemli organellerdir. Bir protein seviyesi, diğer .cellular konumlarda daha sentrozom daha farklı düzenlenmiş olabilir, ve hücre döngüsünün farklı noktalarda çeşitli proteinlerin centrosomal seviyesindeki değişimin sentriol düzeneğinin doğru düzenlenmesi için önemli olduğu görülmektedir. Bu tür hücre döngüsünün farklı aşamalarında veya farklı reaktifler ile muamele edildikten sonra çeşitli örneklerden sabit hücrelerde sentrozom bir protein seviyesinde nispi değişiklik ölçen bir sayısal floresan mikroskobu bir deney geliştirildi. Bu deneyde ilkesi küçük bir bölgede bir proteine karşılık gelen arka düzeltilmiş floresan yoğunluğunun ölçülmesi yer alır ve seçilen deney c değişiklik olmayan başka bir protein için aynı karşı ölçüm normalizeondition. BrdU nabız ve soğukkanlı hücre döngüleri incelemek için takip stratejisi ile birlikte bu testte kullanarak, kantitatif özellikle sentrozomlarla de proteazom aracılı bozulması ile muhtemel VDAC3 ve centrosomal havuz, hücre döngüsü sırasında sentrozomlarla de düzenlenir bizim son gözlem, valide var.
Introduction
Sentrozom pericentriolar malzeme (PCM) 'çevrili Sentriyoller bir çift oluşur. Memeli hücrelerinde büyük mikrotübül organize merkezleri (MTOCs) olmak, sentrozomlar bölünen hücrelerde mitotik iğ iki kutup olarak hizmet, ve böylece genomik bütünlüğünü 1 korumamıza yardımcı olur. (G0 aşamasında örneğin) hareketsiz hücrelerde, sentrozom, yani ana sentriolden iki Sentriyoller biri, primer kirpik, hücre yüzeyi 2 dışarı doğru çıkıntı yapan bir duyusal organel birleştirmek için bir taban gövdesi içine transforme edilir. Hücreler bir kez hücre döngüsü yeniden girmek primer kirpikler parçalarına ve her centriole yavaş yavaş olgun centriole 3 oluşturmak üzere uzar proksimal ucunda bir procentriole montajını yönlendirmektedir. S-fazı başlangıcında, sentriolden 9-katlı bir simetriye sağlayan bir çember benzeri bir yapı olan her sentriolden yüzeyi üzerinde oluşturulmuş olan ve her procentriole baz olacaktır. Sas6 tcentriole montaj cartwheel 4-6 hub oluşturmak için işe edilir için şapka vazgeçilmezdir. Diğer centriolar proteinler daha sonra uzak bir şekilde 7 derece düzenlenir, proksimal tekerin üzerine monte edilir. Tam centriole tekrarını tamamladıktan sonra, hücreler G2 fazı 8 yılı sonunda iki fonksiyonel sentrozomlar inşa ek pericentriolar malzemeleri bir araya getirin. Çekirdek centriolar bileşenler 9-11, kinaz, fosfataz, şaperonlar, iskele elemanları, zara bağlı proteinler ve bozunma makineler dahil olmak üzere birçok başka protein ek olarak hücre döngüsü 12-16 farklı zamanlarda Sentriyoller bazal gövde ve PCM ile ilişkilidir. Genellikle, bir çok proteinin centrosomal seviyeleri geçici olarak centrosomal hedefleme mekanizmalarının ve / veya sentrozom de proteozomal bozulması düzenlenir belirtilmelidir. Önemli bir şekilde, Plk4, Mps1, Sas6 ve CP110 a gibi çeşitli proteinlerin centrosomal düzeyinde dalgalanmalarhücre döngüsünün t farklı noktaları centriole düzeneğinin 5,17-22 düzenleyen önemli olduğu görülmektedir, ve bu centrosomal bozulması önlenir Mps1 durumunda fazla Sentriyoller 19 oluşumuna yol açar. Öte yandan, çeşitli proteinlerin centrosomal fraksiyonlar sitosolik havuzları ile karşılaştırıldığında daha az dayanıksız. Örneğin aşağı doğru düzenlenmesi fotoseli 2 (Cetn2) siRNA aracılı olan bütün hücre seviyeleri 23 büyük azalmaya rağmen Sentriyoller protein düzeyinde yalnızca orta derecede bir azalma sağladı. Oldukça onların centrosome özel fonksiyonları değerlendirilirken tüm hücre protein seviyelerini ölçmek daha centrosome de centrosomal proteinlerin düzeyindeki değişiklikleri ölçmek için bu nedenle çok önemlidir.
Bu çalışmada, sentrozom bir proteinin nispi seviyesini ölçmek için dolaylı immünoflüoresans (IIF) kullanan bir analiz geliştirdik. Bu deney, çeşitli örneklerden olan hücreleri analiz etmek için özellikle geliştirilmiştirve bu nedenle, aynı zamanda görüntülü edilemez. Numuneler farklı zaman noktalarında toplandı farklı reaktifler (örneğin, ilaç kontrole karşı) ile muamele edilmiş olan hücreler olabilir (yani, Chase karşı darbe), ya da hücre döngüsünün farklı aşamalarında bulunmaktadır. Bu deneyde ilkesi arka düzeltilmiş floresan yoğunluğu küçük bir bölgede bir proteine karşılık gelen ve, seviyeleri seçilen deney koşulları altında değişmeyen bir başka protein aynı karşı değer normalleştirmek için ölçüm yatmaktadır. Centrosome biyoloji çeşitli çalışmalar son zamanlarda aday proteinlerin 24-27 arasında centrosome özgü fonksiyonunu belirlemek için, hem canlı ya da sabit hücrelerde çeşitli kantitatif mikroskopi teknikleri, kullanılan var. Bu deneylere benzer şekilde, bu teknik, aynı zamanda test proteinin arka plan düzeltilmiş bir flöresan yoğunluk ölçer. Bununla birlikte, bu tahlilde, bir dahili standart olarak normalleştirme dahil büyük ihtimalle daha teklifdoğruluk ve iki farklı lamelleri üzerinde iki farklı örnekleri analiz güven. Ayrıca, sentrozom protein seviyesinin incelenmesine ek olarak, küçük ayarlamalar ile bu yöntem, deney şartlarının farklı ayarlamak için ya da diğer hücresel sitlerde uygulanabilir.
Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarında hücreleri karşılaştırmak için BrdU darbe-kovalamaca stratejisi ile kantitatif mikroskopi tahlil birleştirir. Bunun yerine, hücre döngüsünün farklı zaman noktalarında çalışma zaman uyumsuz büyüyen hücreler standart hücre döngüsü tutuklama ve serbest bırakma teknikleri kullanılarak S-fazında hücreleri etiketlemek için BrdU ile inkübe edilir, ve etiketlenmiş hücreler, çeşitli zamanlarda (tipik olarak 4-6 saat) boyunca takip edilir. Etiketli hücrelerin çoğu hemen darbesinden sonra S-faz olacaktır. Chase sonra işaretli hücrelerin morfolojik özellikleri nuc göre sentrozom gibi maddelerle pozisyonu tarafından kontrol edilebilir geç S, G2 veya mitoz içinde olacak şekilde Chase uzunluğu seçilirLei, sentrozom arasındaki mesafe, vb kromozom kondansasyon Böylece, kovalama uzunluk S, G2 ve belirli bir hücre tipinin M fazında ortalama süresine bağlıdır. Bu yaklaşım, vb hidroksiüre, afidikolin, nokodazol, hücre döngüsü inhibitörleri önler olduğundan, fizyolojik olarak daha uygun hücre döngüsü analizi sağlar.
Bu yüzden, tek başına nicel floresan mikroskobu deneyi veya BrdU Darbe kovalayıcı tahlilinde ile kombinasyon halinde, doğru bir soğukkanlı hücre döngüsü sırasında aday protein centrosomal seviyesinde göreli değişiklikleri ölçmek için basit ama etkili bir yöntem olduğu burada ortaya koymaktadır. Biz, bu deneyler kullanılarak, VDAC3, son zamanlarda 16,28 mitokondri ek olarak sentrozom de tanımlanan bir protein centrosomal düzeyleri ölçüldü. Burada elde edilen sonuçlar VDAC3 arasında centrosomal havuz bozulması ile düzenlenir bizim daha önceki bir gözlem doğrulamak, ve aynı zamanda bir hücre döngüsü bağımlı hazırlık değişirt şekilde 16, ayrıca bu yöntemin uygulanabilirliğini doğrulanması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre biyolojisinde Kantitatif mikroskopi yaygın sabit farklı nicel mikroskopi deneyleri gelişmekte hücre biyologları artan örnekler vardır, vb Ancak, (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra böyle Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), Floresan Kurtarma gibi canlı hücre görüntüleme deneyleri ile ilişkilidir Son yıllarda 27,34-36 hücreler. Önemlisi, sentrozom biyoloji anlamada ilerleme genellikle centrosomal havuzları diğer havuzlar daha farklı düzenlenebilir proteinlerin cen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
