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생물학

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Published: December 20, 2014
doi:
10.3791/52030
,
1Department of Molecular Genetics,The Ohio State University

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Zentrosomen sind kleine, aber wichtige Organellen, wie die Pole der mitotischen Spindel, um genomische Integrität aufrecht zu erhalten oder zu montieren primären Zilien der Sinnesfunktionen in Zellen zu erleichtern dienen. Der Pegel eines Proteins kann unterschiedlich an Zentrosomen als an anderen Orten .cellular reguliert werden, und die Variation in der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine ​​an unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint für die richtige Regulierung der centriole Anordnung sein. Wir entwickelten eine quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay, der relativen Änderungen der Pegel eines Proteins an Zentrosomen in fixierten Zellen aus verschiedenen Proben, wie in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder nach der Behandlung mit verschiedenen Reagenzien misst. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich, und zu normalisieren, dass die Messung an der gleichen für ein anderes Protein, das nicht unter den gewählten Versuchs c nicht ändertondition. Unter Verwendung dieses Assays in Kombination mit BrdU Impuls und chase Strategie zur ungestörten Zellzyklen zu untersuchen, haben wir quantitativ durch Proteasom-vermittelten Abbau speziell an Zentrosomen validiert unserer jüngsten Beobachtung, daß die zentrosomalen Pool von VDAC3 an Zentrosomen während des Zellzyklus reguliert wird, wahrscheinlich.

Introduction

Zentrosomen bestehen aus einem Paar von Centriolen pericentriolar Material (PCM) umgeben ist. Als die großen Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) in Säugerzellen dienen Zentrosomen als die beiden Pole der mitotischen Spindel in sich teilenden Zellen, und damit zur Erhaltung der genomischen Integrität ein. In ruhenden Zellen (zB während G0-Phase), einer der beiden Centriolen der Zentrosomen, nämlich die Mutter centriole, wird in eine Basaltemperatur transformiert, um die primären Zilien, einen sensorischen Organelle aus der Zelloberfläche herausragen 2 zusammenzubauen. Sobald die Zellen erneut in den Zellzyklus werden die primären Zilien zerlegt und jedes centriole lenkt den Zusammenbau eines procentriole an seinem proximalen Ende, die sich allmählich verlängert, um eine reife centriole 3 bilden. Zu Beginn der S-Phase wird ein Wagenrad artigen Struktur, die das 9-fache Symmetrie um Centriols stellt auf der Oberfläche eines jeden vorhandenen centriole gebildet und wird die Basis jedes procentriole geworden. SAS6 tHut ist unverzichtbar für centriole Baugruppe wird eingestellt, um die Nabe der Wagenrad 4-6 zu bilden. Andere centriolar Proteine ​​werden dann auf das Wagenrad in einem stark reguliert, von proximal nach distal Weise 7 montiert. Nach genau Abschluss centriole Vervielfältigung, Zellen zusammen zusätzliche pericentriolar Materialien zu zwei Funktions Zentrosomen bis Ende G2-Phase 8 bauen. Neben den Kern centriolar Komponenten 9-11, mehrere andere Proteine ​​einschließlich Kinasen, Phosphatasen, Chaperone, Gerüstteile, membranassoziierte Proteine ​​und Abbaumaschinen mit Centriolen, Basalkörpern und PCM zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus 12-16 verbunden. Es wird oft festgestellt, dass die zentrosomale Ebenen vieler Proteine ​​sind zeitlich um zentrosomale Targeting-Mechanismen und / oder auf den proteasomalen Abbau Zentrosomen geregelt. Wichtig ist, dass die Schwankungen der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine ​​wie Plk4, Mps1, SAS6 und CP110 eint unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint entscheidend centriole Anordnung 5,17-22 regulieren zu können, und im Falle von Mps1 Verhinderung dieser zentrosomalen Abbau führt zur Bildung von überschüssigem Centriolen 19. Andererseits sind die zentrosomalen Fraktionen von mehreren Proteinen weniger labil gegenüber cytosolischen Pools. Zum Beispiel Herunterregulierung der Centrin 2 (Cetn2) siRNA-vermittelte führte nur zu einem moderaten Rückgang der Protein-Ebene an den Zentriolen trotz großer Verminderung seiner ganzen Zelle Ebenen 23. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Änderungen in der Ebene der zentrosomalen Proteine ​​am Centrosom anstelle der Messung der Gesamtzellproteinspiegel bei der Bewertung ihrer Zentrosomen spezifische Funktionen zu messen.

In dieser Studie haben wir einen Test unter Verwendung der indirekten Immunfluoreszenz (IIF), das relative Niveau eines Proteins an Zentrosomen zu quantifizieren. Dieser Test ist besonders entwickelt, um Zellen, die aus verschiedenen Proben zu analysierenund können daher nicht gleichzeitig abgebildet werden. Diese Proben können die Zellen, die mit verschiedenen Reagenzien (dh Medikament gegen Kontrolle), die zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, behandelt wurden (dh Pulsgegen chase) oder in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich und um diesen Wert gegen den gleichen für ein anderes Protein, deren Pegel nicht unter den gewählten experimentellen Bedingungen variieren normalisieren. Mehrere Studien in Biologie Zentrosom vor kurzem benutzt verschiedene quantitative Mikroskopie-Techniken, in beiden Live-oder fixierten Zellen, um das Zentrosom-spezifische Funktion der Kandidatenproteine ​​24-27 bestimmen. Ähnlich den Tests misst die vorliegende Technik auch den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität des Testproteins. Jedoch würde die Einbeziehung der Normalisierung mit internem Standard in diesem Test wahrscheinlich größer anbietenGenauigkeit und Sicherheit bei der Analyse von zwei verschiedenen Proben, die auf zwei verschiedenen Deckgläser sind. Ferner, zusätzlich zu der Prüfung des Protein-Ebene zu Zentrosomen, mit geringfügigen Anpassungen dieses Verfahren kann auf einen unterschiedlichen Satz von Testbedingungen oder in anderen zellulären Stellen aufgebracht werden.

Dabei kombinieren wir unsere quantitativen Mikroskopie Assay mit einem BrdU Pulse-Chase-Strategie, um Zellen aus verschiedenen Zellzyklusphasen zu vergleichen. Anstelle der Verwendung von Standard-Zellzyklusarrest und Trenntechniken, um verschiedene Zellzykluszeitpunkten zu untersuchen, asynchron wachsenden Zellen werden mit BrdU inkubiert, um Zellen in die S-Phase zu kennzeichnen, und die markierten Zellen werden für unterschiedliche Zeiten (typischerweise 4-6 Stunden) verfolgt. Die meisten der markierten Zellen in S-Phase unmittelbar nach dem Impuls sein. Die Länge der Lauflicht wird so gewählt, daß nach dem Chase werden markierte Zellen in späten S, G2 oder Mitose voranzuschreiten, was durch morphologische Merkmale wie-Position Zentrosomen bezüglich nuc prüft werden könnenleu, Abstand zwischen Zentrosomen, Kondensation Chromosomen usw. Somit kann die Länge des den Punkt von der mittleren Dauer der S, G2 und M Phase einen bestimmten Zelltyp. Da dieser Ansatz vermeidet Zellzyklus-Inhibitoren, wie Hydroxyharnstoff, Aphidicolin, Nocodazol usw., erlaubt es eine physiologisch relevante Zellzyklusanalyse.

Somit zeigen wir hier, dass die quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay allein oder in Kombination mit BrdU Pulse-Chase-Assay ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, um die relativen Änderungen der zentrosomalen Pegel eines Kandidatenprotein während einer ungestörten Zellzyklus genau zu messen. Wir maßen die zentrosomale Niveau VDAC3, ein Protein, das wir an Zentrosomen zusätzlich kürzlich identifizierten Mitochondrien 16,28, mit diesen Tests. Ergebnisse hier erzielt überprüfen unseren früheren Beobachtungen, dass der Pool von zentrosomale VDAC3 durch Abbau reguliert und variiert ebenfalls in einer Zellzyklus dependent Weise 16, ferner die Validierung der Anwendbarkeit dieses Verfahrens.

Protocol

1. Zellkultur Verwenden menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) verewigt retinalen Pigmentepithelzellen (hTERT-RPE1, die hier als RPE1). HINWEIS: RPE1 Zellen sind nahezu diploiden, nicht-transformierten menschlichen Zellen, die üblicherweise verwendet werden, um die Montage und centriole ciliogenesis studieren. Diese Zellen einer Normal centriole Vervielfältigung Zyklus mit einem geregelten Zellzyklus abgestimmt. Passage eine nahezu konfluente 100 mm Zellkulturschale RPE1 Zell…

Representative Results

Unsere jüngsten Studien identifiziert neuartige zentrosomale Lokalisation und Funktion von VDAC3, einer der mitochondrialen Porine 16,28. Die Immunfärbung von mehreren Säugerzellen, einschließlich RPE1 Zellen unter Verwendung eines VDAC3-spezifischen Antikörper zeigte prominente zentrosomale Färbung und vergleichsweise schwachen mitochondrialen Färbung. Wir haben auch gezeigt, dass zentrosomale VDAC3 wird vorzugsweise mit der Mutter centriole und der zentrosomale Pool sowohl der endogenen und ektopisch…

Discussion

Quantitative Mikroskopie in der Zellbiologie wird häufig mit Live-Cell-Imaging-Assays wie Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Recovery After Photobleaching verbunden (FRAP) usw. Allerdings gibt es wachsende Beispiele für Zellbiologen entwickeln verschiedene quantitative Mikroskopie Assays für feste Zellen in den letzten Jahren 27,34-36. Wichtig ist, dass Fortschritte im Verständnis der Biologie Zentrosom häufig erfordert Verständnis der Zentrosom spezifische Funktion von…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Materials

Name  Company  Catalog number Comments
Fibronectin Sigma F8141 Stock of 1 mg/ml in water
DMSO Sigma D2650
MG115 Sigma SCP0005 Stock of 10 mM in DMSO
BrdU Sigma B5002 Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) Sigma T 6557 1:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)  Aviva Systems Biology ARP35180-P050 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)  Santa cruz biotechnology sc-81431 1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) Abcam ab-75005 1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)  Abcam ab6326 1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Life technologies A21093 1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21202 1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21203 1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21206 1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21207 1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) Sigma T5192 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) Sigma T9026 1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A10043 1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated Rockland antibodies 610-731-002 1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent  Life technologies S36936 Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1 Fisherbrand 12-545-80
Olympus IX-81 microscope Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera QImaging  32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective Olympus 1.4 numerical aperture
Slidebook software package Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay Thermo Scientific 23227
U-MNU2 Narrow UV cube Olympus U-M622 Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube Olympus U-M643 Filter
U-MNU2 Narrow Green cube Olympus U-M663 Filter
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References

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Keywords: Quantitative ImmunofluorescenceProtein LevelsCentrosomesMitotic SpindlePrimary CiliaCell CycleCentriole AssemblyFluorescence MicroscopyVDAC3Proteasome-mediated Degradation
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Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes. J. Vis. Exp. (94), e52030, doi:10.3791/52030 (2014).
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