Kvantitativ Immunfluorescens analysen Mål Variasjon i protein nivåer på Centrosomes

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Centrosomes er små, men viktige organeller som tjener som polene av mitotiske spindel for å opprettholde integriteten genomisk eller montere primære cilia å lette sensoriske funksjoner i celler. Nivået av et protein kan reguleres på en annen måte ved centrosomes enn ved andre .cellular steder, og variasjonen i centrosomal nivået av flere proteiner i forskjellige punkter av cellesyklus synes å være avgjørende for riktig regulering av centriole sammenstilling. Vi har utviklet en kvantitativ fluorescens mikroskopi-analyse som måler relative endringer i nivået for et protein på centrosomes i fikserte celler fra forskjellige prøver, for eksempel ved forskjellige faser av cellesyklusen eller etter behandling med forskjellige reagenser. Prinsippet for denne analyse ligger i å måle bakgrunns korrigert fluorescerende intensitet svarende til et protein ved et lite område, og normal at målingen mot det samme for et annet protein som ikke varierer i henhold til den valgte eksperimentelle condition. Utnytte denne analyse i kombinasjon med BrdU puls og jakt strategi for å studere uaffisert cellesykluser, har vi kvantitativt bekreftet vår siste observasjon at centrosomal pool av VDAC3 reguleres ved centrosomes i løpet av cellesyklusen, sannsynligvis ved proteasom-mediert nedbrytning spesifikt på centrosomes.

Introduction

Centrosomes består av et par av Sentrioler omgitt av pericentriolar materiale (PCM). Å være de store microtubule organisering sentre (MTOCs) i pattedyrceller, centrosomes tjene som de to poler av mitosetråder i dele celler, og dermed bidra til å opprettholde genomisk integritet ^en. I hvilende celler (f.eks, under G0 fase), en av de to Sentrioler av sentrosomen, nemlig moder centriole, blir omdannet til en basal organ for å montere den primære cilium, et sensorisk organell stikker ut fra celleoverflaten ^2. Når cellene gå inn igjen i cellesyklus, er primære cilier demontert og hver centriole dirigerer montering av en procentriole på sin proksimale ende som gradvis forlenges for å danne en moden centriole ^tre. Ved inntreden av S-fase, slå hjul-lignende struktur som gir 9-gangers symmetri til centriole dannet på overflaten av hvert eksisterende centriole og vil bli undersiden av hver procentriole. Sas6 thatten er uunnværlig for centriole forsamlingen er rekruttert for å danne navet i Cartwheel ^4-6. Andre centriolar proteiner blir deretter satt sammen på Cartwheel i en svært regulert, proksimale til distale måte ^7. Etter nettopp fullført centriole duplisering, celler montere ekstra pericentriolar materialer for å bygge to funksjonelle centrosomes innen utgangen av G2 fase ^8. I tillegg til kjerne centriolar komponenter ^9-11, flere andre proteiner inkludert kinaser, fosfataser, anstand, stillaskomponenter, membran tilhørende proteiner og degradering maskiner er forbundet med Sentrioler, basal organer og PCM på ulike tider av cellesyklus ^12-16. Det er ofte bemerkes at centrosomal nivåer av mange proteiner er temporært regulert av centrosomal målretting mekanismer og / eller proteasomal nedbrytning ved centrosomes. Viktigere svingningene i centrosomal nivået av flere proteiner som Plk4, Mps1, Sas6, og en CP110t ulike punkter i cellesyklusen ser ut til å være avgjørende for å regulere centriole montering ^5,17-22, og i tilfelle av Mps1 hindre dette centrosomal degradering fører til dannelsen av overskytende Sentrioler ^19. På den annen side, centrosomal fraksjoner av flere proteiner er mindre labile sammenlignet cytosoliske bassenger. For eksempel siRNA-mediert nedregulering av Centrin 2 (Cetn2) førte til bare en moderat reduksjon av proteinnivå på Sentrioler tross for stor reduksjon i dets hele cellenivåer ^23. Det er derfor viktig å måle endringer i nivået av centrosomal proteinene på sentrosomen heller enn å måle hele celle protein nivåer ved vurdering av deres sentrosomen spesifikke funksjoner.

I denne studien har vi utviklet en analyse ved hjelp av indirekte immunfluorescens (IIF) for å kvantifisere den relative nivået av et protein ved centrosomes. Denne analysen er utviklet spesielt for å analysere celler som er fra forskjellige prøverog dermed ikke kan avbildes på samme tid. Disse prøvene kan være celler som ble behandlet med forskjellige reagenser (dvs. medikament versus kontroll), samlet ved forskjellige tidspunkter (dvs. puls versus chase), eller er i forskjellige faser av cellesyklusen. Prinsippet for denne analyse ligger i å måle bakgrunns korrigert fluorescerende intensitet svarende til et protein ved et lite område, og for å normalisere den verdi mot det samme for et annet protein som har nivåer ikke varierer i henhold til de valgte forsøksbetingelser. Flere studier i sentrosomen biologi har nylig benyttet ulike kvantitative mikroskopi teknikker, både levende eller faste celler, for å fastslå sentrosomen-spesifikk funksjon av kandidat proteiner ^24-27. I likhet med disse assays, den foreliggende teknikk måler også bakgrunnen korrigert fluorescensintensitet av testprotein. Imidlertid vil inkludering av normalisering ved hjelp av en intern standard i denne analysen sannsynligvis gi størrenøyaktighet og trygghet i å analysere to forskjellige prøver som er på to forskjellige dekkglass. Videre, i tillegg til å undersøke protein-nivå på centrosomes, med mindre justeringer av denne metoden kan anvendes på et variert sett av eksperimentelle betingelser, eller ved andre cellulære områder.

Her kombinerer vi vår kvantitative mikros analysen med en BrdU puls-chase strategi for å sammenligne celler fra ulike cellesyklus stadier. Istedenfor å bruke standard cellesyklus-stans og frigjørings teknikker for å studere forskjellige cellesyklus tidspunkter, asynkront voksende celler blir inkubert med BrdU å merke celler i S-fasen, og de merkede celler blir jaget i forskjellige tidsrom (typisk 4-6 timer). De fleste av de merkede celler vil være i S-fase umiddelbart etter pulsen. Lengden på jakten er valgt slik at etter jakten, vil merkede celler være i slutten av S, G2, eller mitose, som kan bekreftes av morfologiske egenskaper som- posisjon av centrosomes med hensyn til nucLei, avstanden mellom centrosomes, kondensasjon av kromosomer etc. Således vil lengden av chase avhenger av den gjennomsnittlige varigheten av S, G2 og M-fasen av en bestemt celletype. Siden denne fremgangsmåten unngår cellesyklus inhibitorer så som hydroksyurea, aphidicholin, nocodazol, etc., gjør det til en mer fysiologisk relevant cellesyklusanalyse.

Således, viser vi her at den kvantitative fluorescensmikroskopi assay alene, eller i kombinasjon med BrdU puls-chase-analysen, er et enkelt, men kraftig teknikk for nøyaktig å måle de relative endringer i centrosomal nivået av en kandidatprotein under en uforstyrret cellesyklusen. Vi målte centrosomal nivå VDAC3, et protein som vi nylig identifisert på centrosomes i tillegg til mitokondriene ^16,28, ved hjelp av disse analysene. Resultater oppnådd her bekrefte vår forrige observasjon at centrosomal pool av VDAC3 er regulert av degradering, og varierer også i en cellesyklus dependent ¹⁶ måte, dessuten å validere anvendelse av denne metoden.

Protocol

1. Cell Culture Bruk menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) udødelig retinal pigment epitelceller (hTERT-RPE1; referert til her som RPE1). MERK: RPE1 celler er nær-diploide, ikke-transformerte humane celler som vanligvis brukes til å studere centriole montering og ciliogenesis. Disse cellene følger en normal centriole duplisering syklus koordinert med regulert cellesyklusen. Passasje en nær sammenflytende 100 mm cellekulturskål av RPE1 celler ved 1: 5 fortynning av den oppr…

Representative Results

Vårt nylige studier identifiserte nye centrosomal lokalisering og funksjon av VDAC3, en av de mitokondrielle poriner 16,28. Farging av flere pattedyrceller inkludert RPE1 celler ved hjelp av en VDAC3-spesifikt antistoff viste fremtredende centrosomal flekker og relativt svak mitokondrie farging. Vi viste også at centrosomal VDAC3 fortrinnsvis knyttet til mor centriole, og centrosomal pool av både endogene og ectopically uttrykt VDAC3 reguleres av degradering 16. For å validere den kvantitative …

Discussion

Kvantitativ mikros i cellebiologi er vanligvis forbundet med levende cellebildeanalyser som fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescens Recovery Etter fotobleking (FRAP), etc. Men det er økende eksempler på cellebiologer utviklings ulike kvantitative mikros analyser for fast celler i de senere år ^27,34-36. Viktigere, fremgang i forståelsen sentrosomen biologi ofte krever forståelse av sentrosomen-spesifikk funksjon av proteiner som centrosomal bassenger kan være regulert annerlede…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter