Electrospun ألياف نانوية السقالات مع التدريجات في منظمة الألياف
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لافتعال السقالات electrospun ألياف نانوية مع منظمة على مراحل من الألياف واستكشاف تطبيقاتها في تنظيم التشكل خلية / التوجه. التدرجات فيما يتعلق الخواص الفيزيائية والكيميائية للالسقالات ألياف نانوية تقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال الطب الحيوي.
Abstract
The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.
Introduction
ألياف النانو هي أداة شعبية لهندسة الأنسجة بسبب قدرتها على تقليد المصفوفة خارج الخلية في هيكلها والحجم النسبي 1. ومع ذلك، بعض واجهات الأنسجة الأم، مثل موقع الإدراج وتر إلى العظم، وتحتوي على ألياف الكولاجين، والتي تظهر على الهيكل التنظيمي المتغير الذي يزيد في محاذاة نحو وتر والنقصان في الموقع العظام 2-5. لذلك، على تجديد الأنسجة فعالة هناك حاجة الى افتعال السقالة التي يمكن أن تحاكي بشكل فعال هذا التدرج الهيكلي.
بحث في السابق، كان هناك أجريت على تغييرات تدريجية في تكوين الألياف، وتحديدا، المحتوى المعدني 6. ومع ذلك، وإعادة العنصر الهيكلي للأنسجة الضامة لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. وتناولت دراسة سابقة التدرجات المورفولوجية من خلال دراسة تأثير السيليكا سطح كثافة الجسيمات على انتشار الخلايا بانية العظم قبي الفئران وجدت في إنفرحد ذاتها العلاقة بين كثافة الجسيمات السيليكا وتكاثر الخلايا 7. ولكن التغييرات الشكلية التي تتوسط تكاثر الخلايا في الأعمال السابقة كانت في معظمها ذات الصلة إلى السطح خشونة تفتقر إلى القدرة في محاكاة التغييرات التنظيمية الألياف 7،8. حاولت إحدى الدراسات الأخيرة إلى افتعال سقالة تحاكي فريدة من نوعها توجهات ألياف الكولاجين باستخدام جامع رواية للغزل كهربائي 9. بينما نجحت هذه الدراسة في إنتاج سقالة مع ألياف كلا الانحياز وعشوائية، فإنه فشل في محاكاة التغيرات التدريجية عرضت في أنسجة الأم. أيضا، في إنتاج مكونات منفصلة، مع تغيير فوري من الانحياز إلى التوجه عشوائي، وخصائص النشاط الحيوي لهذه سقالة انخفضت بشكل ملحوظ. لم يكن هناك عمل سابق قادرة على إنتاج السقالات ألياف نانوية قابلة للتطبيق مع تدرجات المستمرة في توجهات الألياف من الانحياز وعشوائي. وقد أظهرت دراستنا الأخيرة الترفيه الناجح السقالات ألياف نانويةمع التدرج في المؤسسة الألياف التي يمكن أن يحتمل تقليد منظمة الكولاجين الأم في وتر إلى العظام الإدراج 10. ويهدف هذا العمل إلى تقديم البروتوكولات المستخدمة لإنتاج السقالات ألياف نانوية مع الهيكل الذي يشبه أن التنظيم الألياف في واجهة الأم الأنسجة وتر إلى العظام.
هياكل ألياف نانوية التدرج ويحتمل أن تكون التطبيقات عبر مجموعة متنوعة من المجالات بعيدة المدى. ركزنا على تطبيقات لهندسة الأنسجة للموقع الإدراج وتر إلى العظام عن طريق الجمع بين السقالات لدينا مع الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (ADSCs) التي تستخدم بالفعل لتجديد الأنسجة على مختلف ركائز 11-14. وبالإضافة إلى ذلك، ADSCs متشابهة جدا في الطبيعة إلى الخلايا الجذعية نخاع العظام من حيث multipotency ومواردها وفيرة والتي يمكن حصادها باستخدام بسيط 15،16 إجراء شفط الدهون. بذر هذه الخلايا على السقالات على مراحل ألياف نانوية أخرى يعزز تيس بهممقاضاة التطبيقات الهندسية من خلال السماح لتوزيع رقابة من الخلايا التي يحتمل أن تفرق في الأنسجة المختلفة. بالإضافة إلى بذر الخلايا الجذعية، ألياف النانو يمكن أن تكون مغلفة مع الإشارة الجزيئات لتنظيم الاستجابة الخلوية. اقتران nanoencapsulation مع التدرج التنظيمي لهذه السقالات يسمح لدراسة السلوك الخلوي أو التصاميم والطلاء زرع الممكنة. يمكن تغليف جزيئات الوظيفية مثل العظام البروتين المخلق 2 (BMP2)، وهو ما ثبت للحث على بناء العظم التمايز 15،16، تزيد من تعزيز تطبيقات هندسة الأنسجة من هذه السقالات 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.
Fu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا من أموال بدء التشغيل من جامعة نبراسكا المركز الطبي والمعهد الوطني للصحة (عدد المنح 1R15 AR063901-01).
Materials
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion – What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. ‘Aligned-to-random’ nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
