Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

Nanofasern sind eine beliebte Dienstprogramm für das Tissue Engineering die aufgrund ihrer Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix in der Struktur und der relativen Größe ¹ nachahmen. Jedoch können einige native Gewebe Schnittstellen wie die Sehne-Knochen-Insertionsstelle, enthält Kollagenfasern, das eine variable Organisationsstruktur, die in Ausrichtung hin zunimmt Sehne und nimmt an der Knochenstelle ^2-5 aufweisen. Also, für eine effektive Regeneration der Gewebe gibt es eine Notwendigkeit, ein Gerüst, das diesen strukturellen Gradienten effektiv nachahmen herzustellen.

Zuvor hat es Forschung zu langsamen Veränderungen in der Fasermasse durchgeführt, und zwar, Mineralgehalt ^6. Allerdings, wieder die Strukturkomponente des Bindegewebes bleibt weitgehend unerforscht. Eine frühere Studie geprüft morphologischen Gradienten durch die Untersuchung der Wirkung der Oberflächen Siliciumdioxid Teilchendichte auf die Proliferation von Ratten-Schädel Osteoblasten und fanden ein inverse Verhältnis zwischen Kieselsäure Teilchendichte und Zellproliferation ^7. Aber die morphologischen Veränderungen, die in früheren Arbeiten vermittelten Zellproliferation waren meist verwandten Oberflächenrauhigkeit fehlt die Fähigkeit, in Nachahmung Faser organisatorische Veränderungen ^7,8. Eine neuere Studie versucht, ein Gerüst, das die einzigartigen Kollagenfaserorientierungen durch die Verwendung eines neuartigen Kollektor zum Elektro ⁹ nachgeahmt herzustellen. Während dieser Studie gelungen, ein Gerüst mit beiden ausgerichtet und Wirrfasern, versäumt es, die schrittweise Veränderung der nativen Geweben ausgestellt imitieren. Auch bei der Herstellung von Einzelkomponenten, mit einem sofortigen Wechsel von der willkürlichen Orientierung ausgerichtet ist, die biomechanischen Eigenschaften dieses Gerüst deutlich zurückgegangen. Keine frühere Arbeit ist es gelungen, zutreffend Nanofasergerüste mit kontinuierlichen Abstufungen in der Faserorientierungen von fluchtenden und zufälligen erzeugen. Unsere aktuelle Studie hat erfolgreiche Erholung der Nanofasergerüste gezeigtmit Abstufungen in Faser-Organisation, die möglicherweise nachahmen kann das native Kollagen Organisation Sehne-Knochen-Insertion ^10. Diese Arbeit zielt darauf ab, die für die Herstellung von Nanofasergerüste mit einer Struktur, die sehr ähnlich ist, dass der Faser-Organisation in der Landes Sehnen-Knochen-Gewebe-Grenzfläche verwendeten Protokolle zu präsentieren.

Gradient Nanostrukturen möglicherweise weitreichenden Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen. Wir konzentrierten uns auf die Anwendungen auf Tissue Engineering der Sehne-Knochen-Insertionsstelle durch die Kombination unserer Gerüste mit Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die bereits für die Geweberegeneration auf verschiedenen Substraten ^11-14 eingesetzt werden. Darüber hinaus sind ADSCs sehr ähnlich in der Natur, um Stammzellen des Knochenmarks hinsichtlich der Multipotenz und ihre Ressourcen reichlich vorhanden ist, die mit einem einfachen Fettabsaugung ^15,16 geerntet werden können. Seeding diese Zellen auf Nanofasergerüste abgestuft weitere Verbesserung ihrer tisklagen Ingenieuranwendungen, indem es für die gesteuerte Verteilung der Zellen, die potentiell in verschiedenen Geweben differenzieren können. Zusätzlich zum Impfen Stammzellen können Nanofasern mit Signalmolekülen zur Regulierung der zellulären Antwort eingekapselt werden. Koppeln Nanoverkapselung mit der organisatorischen Gradienten dieser Gerüste ermöglicht die Untersuchung von Zellverhalten oder mögliche Implantatdesigns und Beschichtungen. Verkapselung von funktionellen Molekülen, wie morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2), von dem gezeigt wurde, um die Osteoblasten-Differenzierung ^15,16 induzieren könnten weitere Verbesserung der Gewebezüchtung dieser Gerüste ^10.

Protocol

1. Herstellung der Lösung Es wird eine Lösung von Poly (ε-caprolacton) (PCL) (M w = 80.000 g / mol) bei einer ungefähren Konzentration von 100 mg / ml. Löse PCL in einem Gemisch von Dichlormethan (DCM) und N, N-dimethlyformamide (DMF) in einem Verhältnis von 4: 1 (v / v) mit einer Konzentration von 10% (w / v). Legen Sie die Lösung in einem 20 ml Glasröhrchen zum Mischen. Platzieren Glasrohr in Ultraschallreiniger für 30 Minuten oder bis die Lösung durchlässig ist. <p…

Representative Results

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde eine Fasermatte mit einer organisatorischen Gradienten gebildet. 3 zeigt die REM-Bilder an verschiedenen Stellen auf der Nanofaser-Gerüst entnommen. Qualitativ kann bestimmt werden, dass es einen Übergang von der uniaxial ausgerichteter Fasern mit einem 0 mm (3A) zu einer zufälligen Fasersortiment auf 6 mm (Figur 3D). Die FFT liefert einen quantitativen Wert auf die Faserausrichtung, Einzelheiten über die quantitativen Prozes…

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu…

Materials

Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2