섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

Summary

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

나노 섬유는 때문에 구조와 상대적 크기 ^1의 세포 외 기질을 모방 할 수있는 능력의 조직 공학에 대한 인기 유틸리티입니다. 그러나, 이러한 힘줄 투 뼈 삽입 부위의 조직 일부 원시 인터페이스, 힘줄을 향해 정렬 증가 뼈 사이트 ^2-5로 감소 변수 조직 구조를 나타낸다 콜라겐 섬유를 함유한다. 따라서, 효과적인 조직 재생이 효과적으로 구조 구배를 모방 할 수 지지체를 제조 할 필요가있다.

섬유 조성물의 점진적인 변화를 실시 이전 연구되고있다, 즉, 미네랄 함량 ^6. 그러나, 결합 조직의 구조 부품을 다시하면 크게 비경 남아있다. 이전 연구는 쥐의 두 개관 골 모세포의 증식 표면 실리카 입자 밀도의 효과를 연구함으로써 형태학 그라디언트 검사하고 인버 발견실리카 입자 밀도, 세포 증식 ⁽⁷⁾ 사이 SE 관계. 그러나 이전의 연구에서 세포 증식을 매개 형태 학적 변화는 섬유 조직 변경 ^{7, 8을} 흉내 낸의 능력을 결여 표면 거칠기에 주로 관련이 있었다. 최근의 한 연구는 ⁹ 전기 방사에 대한 새로운 컬렉터를 사용하여 고유의 콜라겐 섬유 방향을 모방 발판을 제작하려고했습니다. 이 연구는 모두 정렬 랜덤 섬유와 발판을 생산하는 데 성공하지만, 네이티브 조직에 전시 점진적인 변화를 모방하는 데 실패했습니다. 또한, 임의의 방향에 정렬에서 즉각적인 변화, 별도의 부품을 생산,이 지지체의 생체 역학적 특성은 유의하게 감소 하였다. 아니 이전의 작품은 정렬 된 임의의 섬유 방향에 연속 계조로 적용 나노 섬유 지지체를 생산할 수 없었다. 우리의 최근의 연구는 나노 섬유 지지체의 성공적인 휴양을 보여 주었다잠재적 건 – 투 – 뼈 삽입 ^(10)에서 네이티브 콜라겐 조직을 모방 할 수 섬유 조직의 계조와. 이 작업은 밀접 네이티브 힘줄 투 뼈 조직 인터페이스에서 섬유 조직이 유사한 구조를 갖는 나노 섬유 지지체의 제조에 사용되는 프로토콜을 제공하는 것을 목적으로한다.

그라데이션 나노 섬유 구조는 잠재적으로 다양한 분야에서 응용 프로그램을 광범위한했다. 우리는 이미 다양한 기판 ^11-14 조직 재생을 위해 사용된다 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs) 우리의 발판을 결합하여 건 – 투 – 뼈 삽입 부위의 조직 공학에 응용 프로그램에 초점을 맞추었다. 또한, 다 능성 ADSCs는 측면에서 골수 줄기 세포를 본질적으로 매우 유사하며, 이들 자원은 지방 흡입 간단한 절차 ^{(15, 16)를} 사용하여 수거 할 수있는 풍부하다. 더 계조 나노 섬유 지지체에 이들 세포를 심는 것은 자신의 TIS을 향상잠재적으로 다양한 조직으로 분화 할 수있는 세포의 제어 배포 허용함으로써 엔지니어링 응용 프로그램을 고소. 줄기 세포를 시딩 외에 나노 파이버는 세포 반응의 조절에 신호 분자로 캡슐화 될 수있다. 이러한 비계의 조직 그라데이션 nanoencapsulation 커플 링은 세포 행동이나 가능한 임플란트 디자인과 코팅의 연구 수 있습니다. 조골 세포 ^분화를 유도 ^15,16 도시 된 뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP2), 작용 성 분자의 캡슐화는 또한 이들 지지체 ^(10)의 조직 공학 응용 프로그램을 향상 할 수있다.

Protocol

해결 방법 1. 준비 100 ㎎ / ㎖의 대략적인 농도 폴리 (ε 카프로 락톤) (PCL) (w M = 80,000g / 몰)의 용액을 준비합니다. (4)의 비율로 디클로로 메탄 (DCM)과 N, N-dimethlyformamide (DMF)의 혼합물에 녹이고 PCL : 1 (v / v)로 10 %의 농도를 갖는 (W / V). 혼합하는 20 ㎖ 유리 튜브에서 용액을 놓는다. 30 분 동안 초음파 세척기에 유리 튜브를 배치, 또는 솔루션은 반투명 때까지. <p class="jove_ti…

Representative Results

이 프로토콜을 이용하여, 조직 그라데이션 섬유 매트를 형성 하였다.도 3은 나노 섬유 지지체상의 다양한 위치에서 찍은 SEM 이미지를 도시한다. 질적으로, 그것은 6mm (도 3d)에서 랜덤 섬유 구색 0mm (도 3A)에서 일축 정렬 된 섬유에서 진행이 있는지 판단 할 수있다. FFT는 섬유 정렬을 정량적 가치를 제공, 정량적 프로세스에 대한 세부 사항은 (19)는 여기…

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu…

Materials

Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2