繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

Summary

ここでは、繊維のグラデーション組織とのエレクトロスピンナノファイバー足場を作製し、細胞形態/方向を調節することでアプリケーションを探求するプロトコルを提示する。ナノファイバー足場の物理的および化学的性質に関して勾配が生物医学分野での幅広い用途を提供する。

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

ナノファイバーは、その構造および相対的な大きさ¹で、細胞外マトリックスを模倣する能力の組織工学のための人気のユーティリティである。しかし、このような腱から骨挿入部位のようないくつかの天然の組織界面は、腱に向かって整列して増加し、骨部位^2-5で減少する可変の組織構造を示すコラーゲン線維を含む。そこで、効果的な組織再生のための効果的な構造勾配を模倣し得る足場を作製する必要がある。

以前は、具体的には、ミネラル含有量⁶ファイバー組成が徐々に変化に行われた研究があった。しかし、結合組織の構造成分を再現することは、主に未踏のまま。以前の研究は、ラット頭蓋冠骨芽細胞の増殖に対する表面のシリカ粒子密度の効果を研究することによって、形態学的勾配を調べ、インバーを発見シリカ粒子密度及び細胞増殖⁷とそれの関係。しかし、以前の研究では、細胞増殖を媒介する形態学的変化は、繊維組織変更^7,8を模倣で能力を欠いている粗さを表面主に関連していた。最近の研究では^、9をエレクトロスピニングするための新規なコレクタを使用して、ユニークなコラーゲン繊維の配向を模倣する足場を作製することを試みた。この研究は、両方の整列とランダム繊維と足場を生産することに成功したが、それはネイティブの組織に展示漸進的な変化を模倣することができなかった。また、ランダムな向きに整列からの即時変更で、個別のコンポーネントを製造する際に、この足場の生体力学的特性が大幅に減少した。以前の仕事は、整列とランダムからの繊維配向で連続階調で適用可能なナノファイバー足場を生成することができなかった。我々の最近の研究では、ナノファイバー足場の成功したレクリエーションを示している潜在的に腱·ツー·ボーンの挿入¹⁰で天然コラーゲン組織を模倣することができ、繊維組織内の階調の。この研究は、密接に天然の腱から骨組織界面における繊維組織のそれに似ている構造を有するナノファイバー足場の製造に使用されるプロトコルを提供することを目的とする。

グラデーションナノ構造は、様々な分野での潜在的に遠大な用途がある。我々はすでに様々な基材^11-14上の組織再生のために利用されている脂肪由来幹細胞（ADSCを）と私たちの足場を組み合わせることにより、腱·ツー·骨挿入部位の組織工学への応用に焦点を当てた。また、ADSCのは多分化の観点から骨髄幹細胞の性質が非常に類似しており、それらのリソースは、単純な脂肪吸引手順^15,16を使用して回収することができる豊富である。さらにぼかしナノファイバー足場にこれらの細胞を播種すると、彼らのTISを強化潜在的に様々な組織に分化できる細胞の分布制御を可能にすることによってエンジニアリングアプリケーションを訴える。幹細胞を播種することに加えて、ナノファイバーは、細胞応答の調節シグナル伝達分子をカプセル化することができる。これらの足場の組織的な勾配とのカップリングナノカプセル化は、細胞挙動または可能なインプラントデザインやコーティングの研究のために可能にする。骨芽細胞分化^15,16を誘発すること^が示された骨形成タンパク質2（BMP2）、のような機能性分子のカプセル化は、さらにこれらの足場¹⁰の組織工学アプリケーションを増強できる。

Protocol

ソリューションの調製 100 mg / mlのおおよその濃度で、ポリ（εカプロラクトン）（PCL）（W M =8万グラム/モル）の溶液を調製する。 4の比率でのジクロロメタン（DCM）およびN、N-dimethlyformamide（DMF）の混合物中でPCLを溶解：1（v / v）の10％の濃度（w / v）の。 混合を20 mlのガラスチューブ中の溶液を置き。 30分間超音波洗浄器にガラス管を置き、または溶液は半透明になる?…

Representative Results

このプロトコルを使用して、組織的な勾配を有する繊維マットを形成した。 図3は、ナノファイバー足場上の様々な位置で撮影したSEM像を示す。定性的には、これは6mmで（ 図3D）でのランダム繊維品揃え0ミリメートル（ 図3A）で一軸整列した繊維からの進行があると判断することができる。 FFTは繊維配列に定量値を与え、定量的なプロセスに関する詳細…

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu…

Materials

Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2