Fiber Teşkilatı geçişleri ile electrospun Nanolif iskeleleri

Summary

Burada, biz liflerin Basamaklandırılmış organizasyonu ile electrospun nanolif iskeleleri imal ve hücre morfolojisi / yönünü düzenleyen kendi uygulamalarını keşfetmek için bir protokol mevcut. Nanolif iskelelerinin fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından Degrade'ler biyomedikal alanındaki uygulamalar geniş bir yelpazede sunuyoruz.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

Nanofiberler nedeniyle yapısı ve göreceli büyüklüğü ¹ hücre dışı matriks taklit etme yeteneği doku mühendisliği için popüler bir yarar vardır. Bununla birlikte, örneğin, tendon-kemik girme mevkisi olarak bazı yerel doku arayüzler, tendon karşı uyum artar ve kemik yerinde ^2-5 azalmakta değişken bir organizasyon yapısı sergileyen kollajen lifleri içerir. Bu nedenle, etkin bir doku rejenerasyonu için etkili bir yapısal gradyanı taklit ederek, bir iskele imal etmek için bir gereksinim vardır.

Lif kompozisyonu kademeli değişiklikler üzerinde yapılan Önceleri, orada bir araştırma, özellikle, mineral içeriği ^6. Ancak, bağ dokularının yapısal bileşeni yeniden büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Daha önceki bir çalışmada sıçan Kalvaryal osteoblast çoğalması yüzey silika parçacık yoğunluğu etkisi inceleyerek morfolojik geçişlerini incelemiş ve bir Inver bulundusilika parçacığı yoğunluğu ve hücre çoğalması ^{7 ila} se ilişkisi. Ama daha önceki çalışmalarında hücre çoğalmasını aracılı morfolojik değişiklikler lif organizasyonel değişiklikler ^7,8 taklit kabiliyeti eksik pürüzleri yüzey çoğunlukla ilgili idi. Bir son çalışmada ⁹ elektrospinning için yeni bir toplayıcı kullanarak benzersiz kollajen lif yönelimleri taklit bir iskele türettiğini. Bu çalışmada hem hizalanmış ve rastgele lifleri ile bir iskele üretiminde başarılı iken, doğal dokuların sergilenen kademeli değişiklikleri taklit etmek başarısız oldu. Aynı şekilde, rasgele yönlendirmeye hizalanmış bir ani değişim ile, ayrı bileşenlerin üretiminde, bu skafold biyomekanik özelliklerini önemli ölçüde azalmıştır. Hiçbir önceki çalışmaları hizalanmış ve rastgele fiber yönelimleri sürekli geçişler ile geçerli nanolif iskeleleri üretmek mümkün olmuştur. Bizim son çalışmada Nanolif iskelelerinin başarılı rekreasyon göstermiştirpotansiyel tendon-kemik ekleme ¹⁰ de yerli kollajen organizasyonu taklit fiber organizasyonunda geçişleri ile. Bu çalışma yakından yerli tendon-kemik doku arayüzü lif örgüt andıran bir yapıya sahip Nanolif iskelelerinin üretimi için kullanılan protokoller sunmayı amaçlamaktadır.

Degrade nanolif yapıları potansiyel alanlarda çeşitli genelinde uygulamaları geniş kapsamlı oylandı. Biz zaten çeşitli yüzeylerde ^11-14 doku rejenerasyonu için kullanılmaktadır adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSCs) ile iskeleleri birleştirerek tendon-kemik ekleme sitenin doku mühendisliği uygulamaları üzerinde duruldu. Buna ek olarak, ADSCs multipotency açısından, kemik iliği kök hücreleri, doğada çok benzerdir ve kaynak basit bir yağ emme işlemi ^15,16 kullanılarak hasat edilebilir boldur. Daha gradated nanolif iskeleleri bu hücrelerin ekim kendi tis artırırPotansiyel çeşitli dokulara ayırt edebilir hücrelerin kontrollü dağıtımı için izin vererek mühendislik uygulamaları dava. Kök hücre ekim ek olarak, nanolifler hücre tepkisinin düzenlenmesi için sinyal molekülleri ile kapsüllenebilmektedir. Bu iskelelerinin örgütsel gradyan ile nanoencapsulation bağlanması hücresel davranış veya olası implant tasarımları ve kaplamaların çalışma için izin verir. Osteoblast farklılaşmasını ^15,16 indüklediği gösterilmiştir kemik morfogenetik protein 2 (BMP2), gibi fonksiyonel moleküllerin Kapsülleme ayrıca bu iskeleler ¹⁰ arasında doku mühendisliği uygulamaları geliştirmek olabilir.

Protocol

Çözüm 1. Hazırlık 100 mg / ml'lik uygun bir konsantrasyonda Poli (ε-kaprolakton) (PCL), (a, M = 80,000 g / mol) içindeki bir çözeltisi hazırlandı. 4 bir oranda, diklorometan (DCM) ve N, N-dimethlyformamide (DMF) içindeki bir karışımı içinde PCL çözülür: 1 (v / v)% 10 bir konsantrasyona sahip (ağırlık / hacim). Karıştırma için 20 ml'lik bir cam tüp içinde çözelti yerleştirin. 30 dakika ultrasonik süpürge içine cam tüp koyun ya da çözelti berra…

Representative Results

Bu protokol kullanılarak, bir kuruluş gradyanı ile, bir elyaf matın oluşturulmuştur. Şekil 3, nano yapı iskelesi üzerinde farklı yerlerde alındığı SEM görüntülerini göstermektedir. Kalitatif olarak, bu 6 mm (Şekil 3D), rasgele bir lif karışımı göz 0 mm (Şekil 3A) tek eksenli olarak yerleştirilen fiberlerin bir ilerleme olduğu tespit edilebilir. FFT elyaf hizalama bir nicel değer verir, sayısal süreçlere özelliklerini 19 burada …

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu…

Materials

Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2