Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Met behulp van kippenembryo's is het mogelijk om direct de effecten van beide groeifactoren of specifieke remmers van signaaltransductiewegen op genexpressie en activering van signaaltransductieroutes testen. Deze techniek maakt de afgifte van signaalmoleculen op exact gedefinieerde ontwikkelingsstadia specifieke tijden. Na deze embryo's kunnen worden geoogst en genexpressie onderzocht, bijvoorbeeld door in situ hybridisatie, of activering van signaaltransductieroutes waargenomen met immunokleuring.

In deze video heparine kralen gedrenkt in FGF18 of AG 1-X2 kralen gedrenkt in U0126, een MEK-inhibitor, worden geënt in de ledematen kiem in ovo. Hieruit blijkt dat FGF18 induceert expressie van MyoD en ERK fosforylatie en zowel endogene als FGF18 MyoD geïnduceerde expressie wordt geremd door U0126. Kralen gedrenkt in een retinoïnezuur antagonist kan voortijdige MyoD inductie versterken door FGF18.

Deze aanpak kan onsed met een groot aantal verschillende groeifactoren en remmers en wordt gemakkelijk aangepast aan andere weefsels in het ontwikkelende embryo.

Introduction

Aviaire embryo's een krachtig hulpmiddel voor de studie van ontwikkeling bedoeld jaren ^1. Een van hun meest nuttige eigenschappen is dat ze relatief gemakkelijk te manipuleren. Externe ontwikkeling maakt het mogelijk om het ei te openen om het embryo en uitvoeren van verschillende micromanipulations met voorbeelden zoals de klassieke kwartel-chick chimera voor het bestuderen lot van de cel ^2,3, de injectie van retrovirussen voor overexpressie in specifieke weefsels tijdens de ontwikkeling ^4,5 en explantatie cultuur ontwikkelingsstoornissen signalering bronnen ⁶ identificeren. Meer recent hersenschimmen gegenereerd tussen ongelabelde gastheren met enten van een transgene kippen lijn die GFP heeft aangetoond dat de combinatie van klassieke enten en genetische modificatie belangrijke inzichten kunnen geven in de ontwikkeling van ^7,8.

Het gemak waarmee het aviaire embryo kan worden gemanipuleerd heeft gemaakt een uitstekend model voor de studie ledematenontwikkeling ^9. Toepassing van specifieke groeifactoren aan de ontwikkeling van ledematen in vivo is behulpzaam geweest bij het ​​identificeren van factoren die ledematen patronen ^10,11 veranderen en blijft om inzicht te geven in dit proces ¹² geweest. Deze aanpak is ook gebruikt om de factoren die spierontwikkeling regelen bestuderen en heeft rollen voor diverse signalen zoals Wnts ^13, BMP's ¹⁴ en ¹⁵ HGF blootgelegd.

Recent werd deze techniek gebruikt om de signalen te besturen myogene genexpressie in de ledemaatknop onderzoeken en blijkt dat de interacties tussen FGF18 en retinoïnezuur het tijdstip van MyoD expressie ¹⁶ kan besturen. Met een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen die op kralen kunnen worden geladen en vervolgens direct geënt in specifieke weefsels in ontwikkelingsstadia gedefinieerde geeft de mogelijkheid om op bijna elk moment en omgeving ingrijpen tijdens de ontwikkeling. Deze is gebruikt om INVEstigate veel processen waaronder somiet patroonvorming ^17,18, neurale specificatie ^19, neurale lijst migratie ^{20 en} as uitbreiding ^21.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het enten korrels geweekt in beide groeifactoren of inhibitors in ontwikkelende kippenembryo ledematen. Deze is gebruikt om het effect van deze signalen op myogenesis bepalen door het analyseren spieren genexpressie met in situ hybridisatie. We beschrijven implantaten met behulp van heparine geweekte korrels, die worden gebruikt voor groeifactoren of AG 1-X2 parels voor kleine hydrofobe moleculen zoals retinoïnezuur of kleine molecule inhibitoren van specifieke signaleringsroutes. Maar andere kralen zijn ook beschikbaar, die zijn gebruikt om zowel FGF's ²² en ²³ Shh leveren.

Protocol

Ethiek Verklaring: Al deze experimenten volgen het dier zorg en ethische richtlijnen van de Universiteit van Nottingham. 1. Voorbereiding van de Heparine Kralen voor Enten Was heparine korrels grondig in PBS vóór gebruik. Opmerking: Parels kunnen bij 4 ° C worden bewaard als een suspensie in PBS. Selecteer kralen voor enten door het verwijderen van hen uit de voorraad met een 20 ul pipet in een 1 ml daling van PBS. Gebruik een micropipet ingesteld op 2…

Representative Results

Bij HH stadium 21 MyoD niet wordt uitgedrukt in ontwikkelingslanden ledematen myoblasten hoewel kleuring te zien in de myotoom van de ontwikkeling somieten (Figuur 1A). Figuur 1B toont in situ hybridisatie voor MyoD 6 uur na FGF18 kraal graft. MyoD wordt geïnduceerd in myoblasten nabij de hiel terwijl er geen expressie in de contralaterale ledemaat. Co-enten een kraal gedrenkt in U0126, een specifieke remmer van MEK, blokken FGF18 inductie van MyoD (figuur 1C).</strong…

Discussion

Het gebruik van kralen grafts rechtstreeks op ontwikkelende weefsels in ovo is een krachtig hulpmiddel om de rol van de groeifactor signalering ontleden tijdens de ontwikkeling die ongekende controle over het ontwikkelingsstadium waarin zij worden toegepast en de blootstellingsduur.

De keuze van de kraal voor elk type molecuul van belang. Kleine hydrofobe moleculen, zoals beschreven remmers en retinoïnezuur, goed binden gewoonlijk gederivatiseerde AG 1-X2 korrels hoewel het noodzakelijk om …

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS