Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Usando embriões de galinha, é possível testar directamente os efeitos de ambos os factores de crescimento específicos ou inibidores das vias de sinalização sobre a expressão do gene e a activação das vias de transdução de sinal. Esta técnica permite a entrega de moléculas de sinalização em estágios de desenvolvimento definidos com precisão para horários específicos. Após esta embriões podem ser colhidas e a expressão de genes examinados, por exemplo, por hibridação in situ, ou a activação de vias de transdução do sinal observado com a imunocoloração.

Neste contas de heparina vídeo embebido em FGF18 ou grânulos AG 1-X2 embebidas em U0126, um inibidor MEK, são enxertados no botão do membro in ovo. Isto mostra que induz a expressão de FGF18 MyoD e fosforilação de ERK e tanto endógena e FGF18 induzida MyoD expressão é inibida por U0126. Grânulos embebidos em um antagonista do ácido retinóico pode potenciar a indução precoce MyoD por FGF18.

Esta abordagem pode ser-nosed com uma vasta gama de diferentes factores de crescimento e inibidores e é facilmente adaptado a outros tecidos no embrião em desenvolvimento.

Introduction

Embriões de aves forneceram uma ferramenta poderosa para o estudo do desenvolvimento de muitos anos ^1. Uma das suas características mais útil é que eles são relativamente fáceis de manipular. Desenvolvimento externo faz com que seja possível abrir o ovo para aceder ao embrião e executar várias micromanipulations incluindo exemplos, tais como o sistema de quimera de codorniz-do pintainho clássica para o estudo de ^2,3 destino celular, a injecção de retrovirus para a sobre-expressão em tecidos específicos durante o desenvolvimento ^4,5 e cultura explante para identificar fontes de sinalização de desenvolvimento ^6. Mais recentemente quimeras gerado entre hosts não marcados com enxertos de uma linha de galinha transgênica expressando GFP mostrou que a combinação de enxertia clássica e modificação genética pode fornecer importantes insights sobre o desenvolvimento ^7,8.

A facilidade com que o embrião aviário pode ser manipulado fez-se um excelente modelo para o estudo do membrodesenvolvimento ^9. Aplicação de fatores de crescimento específicos para membros em desenvolvimento in vivo tem sido fundamental na identificação de fatores que alteram membro padronização ^10,11 e continua a fornecer insights sobre este processo ^12. Essa abordagem também tem sido usado para estudar os fatores que regulam o desenvolvimento muscular e descobriu papéis para numerosos sinais como Wnts ^13, BMPs ^{14 e 15} HGF.

Recentemente, esta técnica tem sido utilizada para investigar os sinais que controlam a expressão do gene miogénica nos brotos dos membros e tem mostrado que as interacções entre o ácido retinóico e FGF18 pode controlar o tempo de expressão ^{de 16} MyoD. Usando uma combinação de fatores de crescimento e moléculas pequenas que podem ser carregados em esferas e, em seguida, enxertadas diretamente em tecidos específicos em estágios de desenvolvimento definidas dá a oportunidade de intervir em quase qualquer hora e região durante o desenvolvimento. Isto tem sido utilizado para investigate muitos processos, incluindo somite padronização ^17,18, especificação neural ^19, migração da crista neural ^{20 e 21 de} extensão do eixo.

Descrevemos aqui um método para o enxerto grânulos embebidos em ambos os factores de crescimento no desenvolvimento de inibidores ou membros de galinha. Este foi usado para determinar os efeitos destes sinais na miogénese, analisando a expressão do gene específico do músculo com a hibridização in situ. Nós descrevemos enxertos utilizando heparina grânulos embebidos, os quais são utilizados para factores de crescimento, ou grânulos AG 1-X2 para pequenas moléculas hidrófobas tais como o ácido retinóico ou pequenas moléculas inibidoras de vias específicas de sinalização. No entanto outros grânulos também estão disponíveis, que têm sido utilizadas para entregar ambas FGF Shh ^{22 e 23.}

Protocol

Declaração de Ética: Todas estas experiências seguem o cuidado com os animais e as diretrizes éticas da Universidade de Nottingham. 1. Preparação de heparina Beads para enxertia Lave cuidadosamente contas de heparina em PBS antes da utilização. Nota: contas podem ser armazenadas a 4 ° C como uma suspensão em PBS. Seleccionar os grânulos para enxerto, removendo-os do estoque com uma pipeta de 20 uL a uma queda de 1 ml de PBS. Em seguida, usar u…

Representative Results

Na fase HH 21 MyoD não é expresso em mioblastos em desenvolvimento de membros embora coloração pode ser visto na miótomo dos somitos em desenvolvimento (Figura 1A). A Figura 1B mostra a hibridização in situ para MyoD 6 horas no seguimento de um enxerto FGF18 grânulo. MyoD é induzida em mioblastos perto do rebordo, enquanto não há expressão no membro contralateral. Co-enxerto de um grânulo embebido em U0126, um inibidor específico da MEK, a indução de blocos FGF1…

Discussion

A utilização de enxertos de talão aplicados directamente para o desenvolvimento de tecidos in ovo é uma ferramenta poderosa para dissecar o papel do crescimento factor de sinalização durante o desenvolvimento dando controlo sem paralelo através da fase de desenvolvimento em que elas são aplicados e a duração da exposição.

A escolha de grânulo para cada tipo de molécula é importante. Pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como os inibidores aqui descritos e ácido retinóico, …

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS