Intensification des Perles dans le développement d'embryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l'expression des gènes

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Utilisation des embryons de poulet, il est possible de tester directement les effets soit de facteurs de croissance ou des inhibiteurs spécifiques de voies sur l'expression des gènes et l'activation des voies de transduction de signaux de signalisation. Cette technique permet la livraison de molécules à des stades de développement définis avec précision pour des moments précis de signalisation. Après cela, les embryons peuvent être récoltées et l'expression des gènes examinés, par exemple par hybridation in situ, ou l'activation des voies de transduction de signaux observées par immunocoloration.

Dans cette vidéo, perles d'héparine trempés dans FGF18 ou AG perles 1-X2 trempés dans U0126, un inhibiteur de MEK, sont greffés dans le bourgeon de membre in ovo. Cela montre que FGF18 induit l'expression de MyoD et la phosphorylation de ERK et d'expression à la fois endogène et FGF18 induite MyoD est inhibée par U0126. Perles trempés dans un antagoniste de l'acide rétinoïque peuvent potentialiser prématurée MyoD induction par le FGF18.

Cette approche peut être noused avec un large éventail de facteurs différents et les inhibiteurs de croissance et est facilement adaptée à d'autres tissus de l'embryon en développement.

Introduction

Embryons aviaires ont fourni un outil puissant pour l'étude du développement depuis de nombreuses années ^1. Un de leurs caractéristiques les plus utiles est qu'ils sont relativement faciles à manipuler. Développement externe permet d'ouvrir l'œuf pour accéder à l'embryon et effectuer diverses micromanipulations y compris des exemples tels que le système de chimère caille-poulet classique pour étudier le destin des cellules ^2,3, l'injection de rétrovirus pour surexpression dans des tissus spécifiques au cours du développement ^4,5 et explant pour identifier les sources de signalisation de développement ^6. Plus récemment chimères généré entre les hôtes non étiquetés avec greffes provenant d'une lignée de poulet transgénique exprimant la GFP a montré que la combinaison de greffage classique et modification génétique peut fournir des informations importantes sur le développement ^7,8.

La facilité avec laquelle l'embryon aviaire peut être manipulé en a fait un excellent modèle pour l'étude de branche⁹ développement. Application des facteurs de croissance spécifiques aux membres en développement in vivo a joué un rôle dans l'identification des facteurs qui modifient branche structuration ^10,11 et continue de fournir des indications sur ce processus ^12. Cette approche a également été utilisée pour étudier les facteurs qui régulent le développement musculaire et a découvert de nombreux rôles pour les signaux tels que Wnts ^13, HGF PGB ^{14 et 15.}

Récemment, cette technique a été utilisée pour étudier les signaux contrôlant l'expression du gène myogénique dans le bourgeon de membre et a montré que les interactions entre FGF18 et l'acide rétinoïque peuvent contrôler le moment de l'expression de MyoD ^16. En utilisant une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules qui peuvent être chargés sur des billes puis greffées directement dans les tissus spécifiques à des stades de développement définis donne la possibilité d'intervenir à presque tout moment et la région au cours du développement. Cela a été utilisé pour investigate de nombreux processus, y compris la structuration ^17,18 somites, la spécification de neurones ^19, la migration de la crête neurale ²⁰ et l'extension de l'axe ^21.

Nous décrivons ici un procédé de greffage des perles trempées dans soit des facteurs de croissance ou des inhibiteurs dans le développement des membres de poulet. Cela a été utilisé pour déterminer les effets de ces signaux sur la myogenèse par l'analyse de l'expression génique spécifique du muscle avec une hybridation in situ. Nous décrivons des greffons en utilisant soit des perles trempées héparine, qui sont utilisés pour des facteurs de croissance, ou des perles AG 1-X2 pour les petites molécules hydrophobes tels que l'acide rétinoïque ou de petites molécules inhibitrices de voies de signalisation spécifiques. Cependant, d'autres perles sont également disponibles qui ont été utilisées pour fournir à la fois FGF ^{22 et 23} Shh.

Protocol

Déclaration éthique: Toutes ces expériences suivent le soin des animaux et les directives éthiques de l'Université de Nottingham. 1. Préparation des billes d'héparine pour le greffage Lavez perles d'héparine soigneusement dans du PBS avant de l'utiliser. Remarque: Les billes peuvent être conservées à 4 ° C sous forme de suspension dans du PBS. Choisir des perles pour le greffage en les retirant du stock avec une pipette de 20 p…

Representative Results

A l'étape 21 HH MyoD est pas exprimée dans le développement des membres myoblastes bien que la coloration peut être vu dans le myotome des somites en développement (Figure 1A). La figure 1B montre l'hybridation in situ pour MyoD six heures suivant une greffe de talon FGF18. MyoD est induite dans les myoblastes à proximité de la bille tandis que il n'y a aucune expression dans le membre contralateral. Co-greffage d'un bourrelet trempé dans U0126, un inhib…

Discussion

L'utilisation de greffons de perles appliquées directement au développement des tissus in ovo est un outil puissant pour disséquer le rôle de la signalisation du facteur de croissance au cours du développement donnant un contrôle inégalé sur le stade de développement à laquelle ils sont appliqués et la durée d'exposition.

Le choix du bourrelet pour chaque type de molécule est importante. Les petites molécules hydrophobes, tels que les inhibiteurs décrits ici et l'a…

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS