L'innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l'espressione genica

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Usando embrioni di pollo è possibile testare direttamente gli effetti delle due fattori di crescita o inibitori specifici di vie di segnalazione di espressione genica e attivazione di vie di trasduzione del segnale. Questa tecnica permette la consegna di molecole di segnalazione in stadi di sviluppo ben definiti per i tempi specifici. Dopo questo embrioni possono essere raccolte e l'espressione genica esaminati, ad esempio in situ ibridazione, o l'attivazione di vie di trasduzione del segnale osservato con immunocolorazione.

In questo video di eparina perline imbevuti di FGF18 o AG perline 1-X2 imbevute di U0126, un inibitore di MEK, si innestano nel bocciolo arto in ovo. Questo dimostra che FGF18 induce l'espressione di MyoD e ERK fosforilazione e espressione MyoD sia endogena e FGF18 indotta è inibito dalla U0126. Perline imbevuto di un antagonista dell'acido retinoico possono potenziare l'induzione prematura MyoD da FGF18.

Questo approccio può essere noied una vasta gamma di fattori di crescita e inibitori e si adatta facilmente ad altri tessuti embrioni.

Introduction

Embrioni aviaria hanno fornito un potente strumento per lo studio di sviluppo per molti anni ^1. Una delle loro caratteristiche più utili è che sono relativamente facili da manipolare. Sviluppo esterno consente di aprire l'uovo per accedere l'embrione ed eseguire varie micromanipolazioni con esempi come il sistema chimera quaglia-chick classico per lo studio il destino della cellula ^2,3, l'iniezione di retrovirus per sovraespressione in tessuti specifici durante lo sviluppo ^4,5 e la cultura espianto di identificare le fonti di segnalazione di sviluppo ^6. Più recentemente chimere generato tra gli host non etichettati con innesti da una linea pollo transgenici che esprimono GFP ha dimostrato che la combinazione di innesto classica e la modificazione genetica in grado di fornire importanti intuizioni sviluppo ^7,8.

La facilità con cui l'embrione aviaria può essere manipolato ha reso un ottimo modello per lo studio degli artisviluppo ^9. L'applicazione di fattori di crescita specifici per gli arti in via di sviluppo in vivo è stato fondamentale per identificare i fattori che alterano arto patterning ^10,11 e continua a fornire intuizioni in questo processo ^12. Questo approccio è stato utilizzato anche per studiare i fattori che regolano lo sviluppo muscolare e ha scoperto ruoli per numerosi segnali, come Wnts ^13, BMP ^{14 e} HGF ^15.

Recentemente questa tecnica è stata utilizzata per studiare i segnali che controllano l'espressione genica myogenic sul nascere degli arti e ha dimostrato che le interazioni tra FGF18 e acido retinoico può controllare i tempi di espressione MyoD ^16. Usando una combinazione di fattori di crescita e piccole molecole che possono essere caricati su perline e poi innestate direttamente nei tessuti specifici a stadi di sviluppo definiti dà la possibilità di intervenire in quasi ogni momento e regione durante lo sviluppo. Questo è stato usato per investigate molti processi tra cui somite patterning ^17,18, specificazione neurale ^19, neural crest migrazione ²⁰ e l'estensione dell'asse ^21.

Qui si descrive un metodo per perline imbevute di entrambi i fattori di crescita o inibitori nello sviluppo di arti di pollo innesto. Questo è stato utilizzato per determinare gli effetti di questi segnali su miogenesi analizzando muscolo espressione genica specifica con ibridazione in situ. Descriviamo innesti utilizzando eparina imbevuto perline, che sono utilizzati per fattori di crescita, o perline AG 1-X2 per piccole molecole idrofobe quali acido retinoico o piccole molecole inibitrici di vie di segnalazione specifici. Tuttavia altre perle sono disponibili che sono stati utilizzati per fornire sia FGFs ^{22 e 23} anche Shh.

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e le linee guida etiche del l'Università di Nottingham. 1. Preparazione di Beads eparina per innesto Lavare accuratamente perle di eparina in PBS prima dell'uso. Nota: Beads possono essere conservati a 4 ° C come una sospensione in PBS. Selezionare perline per innesto rimuovendoli dal magazzino con una pipetta 20 microlitri in una goccia 1 ml di PBS. Quindi utilizzare un…

Representative Results

Nella fase HH 21 MyoD non è espresso in mioblasti sviluppo arto sebbene colorazione può essere visto in myotome dei somiti sviluppo (Figura 1A). Figura 1B mostra ibridazione in situ per MyoD 6 ore dopo un innesto FGF18 tallone. MyoD è indotta in mioblasti vicino al tallone, mentre non vi è alcuna espressione nell'arto controlaterale. Co-innestando un branello imbevuto U0126, un inibitore specifico di MEK, induzione blocchi FGF18 di MyoD (Figura 1C). All…

Discussion

L'utilizzo di innesti tallone applicati direttamente allo sviluppo di tessuti in ovo è un potente strumento per analizzare il ruolo del fattore di crescita di segnalazione durante lo sviluppo dando il controllo senza precedenti sopra lo stadio di sviluppo in cui vengono applicate e la durata dell'esposizione.

La scelta del cordone per ogni tipo di molecola è importante. Piccole molecole idrofobe, come gli inibitori qui descritte ed acido retinoico, di solito si legano bene al deriv…

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS