عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية
Summary
Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Abstract
على الرغم من التقدم في فهم الرأس والعنق سرطان الخلايا الحرشفية (HNSCC) تقدم، يبقى معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات منخفضا بسبب تكرار المحلية والانبثاث البعيد. إحدى الفرضيات لتفسير هذا تكرار هي وجود سرطان خلايا شبيهة بخلايا المنشأ (الجذعية السرطانية) التي تقدم chemo- الكامنة والإذاعة المقاومة. من أجل وضع استراتيجيات علاجية جديدة، فمن الضروري أن يكون هناك نماذج التجريبية التي تحقق فعالية من العلاجات المستهدفة، وبالتالي لديها وسائل موثوق بها لتحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية. تحقيقا لهذه الغاية، نقدم بروتوكول لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC الإنسان أن يعتمد على مزيج من اثنين من sortings المتعاقبة الخلية التي يقوم بها مضان خلية تنشيط الفرز (FACS). ويستند أول واحد على الممتلكات الخلايا الجذعية السرطانية إلى بإفراط ATP-التجليد كاسيت (ABC) بروتينات نقل، وبالتالي استبعاد، من بين أمور أخرى، والأصباغ الحمض النووي الحيوية مثل هويشت 33342. الخلايا فرزها مع الويتم تحديد طريقة ك "سكان الجانب" (SP). كما تمثل الخلايا SP نسبة منخفضة (<5٪) من الخلايا الأبوية، في مرحلة النمو أمر ضروري من أجل زيادة عددهم قبل الفرز الخلية الثانية. الخطوة التالية تسمح لاختيار الخلايا التي تمتلك اثنين من الخصائص الخلايا الجذعية HNSCC أخرى أي مستوى التعبير عال من علامة سطح الخلية CD44 (CD44 عالية)، والإفراط في التعبير عن نازعة ألدهيد (عالية ALDH). لأن استخدام علامة واحدة لديها العديد من القيود والعثرات لعزل الخلايا الجذعية السرطانية، والجمع ليرة سورية، وCD44 وعلامات ALDH توفر أداة مفيدة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية لمزيد من المقايسات التحليلية وظيفية تتطلب خلايا قابلة للحياة. تم التحقق من صحة خصائص تشبه الجذعية الخلايا الجذعية السرطانية في نهاية المطاف في المختبر عن طريق تشكيل tumorispheres والتعبير عن β-كاتينين.
Introduction
الرأس والرقبة الخلايا الحرشفية سرطان (HNSCC) هي خباثة مشتركة في جميع أنحاء العالم، وعلى الرغم من التقدم في العلاجات الحالية، والمرضى الذين يعانون من مرض متقدم لها بسوء التشخيص. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الشامل للمريض حوالي 30٪ على الرغم من مزيج من الطرق العلاجية بما في ذلك الجراحة، العلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي والعلاجات المستهدفة. وتعزو الدراسات الحديثة تكرار المحلية والانبثاث البعيد لبقاء الخلايا السرطانية شبيهة بخلايا المنشأ (الجذعية السرطانية) بعد العلاجات المضادة للسرطان 1. وهناك أدلة تراكم دعم وجود خلايا تقديم الخلايا الجذعية خصائص (وضع غير متمايز، تجديد الذات والتمايز القدرات، والنشاط التيلوميراز) في الأورام الصلبة المختلفة بما في ذلك الثدي والدماغ والبروستاتا والرئة والقولون والبنكرياس والكبد والجلد 2- 10. ومع ذلك، فإن أصل الخلايا الجذعية السرطانية لا يزال من غير الواضح 11،12. ويمكن أن ينتج عن التحول السرطاني للخلايا الجذعية العادية 3،13 أو dedifferentiation من الخلايا السرطانية التي تحصل على ميزات الخلايا الجذعية السرطانية مثل 14،15. ولذلك، فهم مسارات مميزة تتعلق الخلايا الجذعية السرطانية ستوفر نظرة ثاقبة على تشخيص وعلاج HNSCC مقاومة في وقت مبكر.
وقد اقترح أن الخلايا الجذعية السرطانية تمتلك أيضا الظواهر مقاومة تتهرب من العلاج الكيماوي التقليدي والعلاج الإشعاعي، مما أدى إلى انتكاس الورم مقارنة مع الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية 16-19 وتكون مترجمة إلى نقص الأوكسجين الكوات 20. وقد اقترحت عدة عوامل لتفسير هذه المقاومة الخلايا الجذعية السرطانية، مثل الميل إلى السكون، وتعزيز إصلاح الحمض النووي، وآليات الرقابة دورة الخلية يصل التنظيم، والكسح الجذور الحرة 21. وعلاوة على ذلك، العديد من المسارات الجزيئية أنكجنيك قد يتم تفعيلها على وجه التحديد في الخلايا الجذعية السرطانية 17. من أجل تحسين المعرفة الخلايا الجذعية السرطانية مقابل العلاجات المستهدفة أبعد من ذلك، نحن بحاجة الى طرق يمكن الاعتماد عليها لتحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية، وذلك بسبب عدم تجانس علامات ذات الصلة الخلايا الجذعية فيأنواع مختلفة من السرطانات 22.
في HNSCC، وقف مثل تم عزلها الخلايا السرطانية بدء من أورام المريض الأساسي عن طريق فرز الخلايا معربا عن المؤشرات الحيوية CSC مختلفة (مثل هروب رأس المال المخدرات النقل التعبير 23، CD44 عالية، CD24 CD133 ارتفاع منخفض، ج-الأرصاد + النمط الظاهري 10،24، 25، أو ALDH ارتفاع النشاط 26) أو زراعة ورم المريض الأساسي لتشكيل squamospheres التي لها خصائص ديوان الخدمة المدنية. ومع ذلك، فإن عددا من squamospheres يقلل بشكل كبير بعد اثنين من الممرات، مما يعطي حجم العينة صغير لمزيد من التوصيف يدرس 27. لذلك، فحوصات في المختبر بدءا من خطوط الخلايا راسخة هو الحل الأسهل لتصميم التجارب من أجل تحسين المعرفة الخلايا الجذعية السرطانية.
والهدف من هذه المقالة هو اقتراح طريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC باستخدام multiparametric تدفق cytometric التحليلالثانية خلية الفرز. التعبير عن CD44 في علاقة مع العديد من الخصائص الخلايا الجذعية السرطانية بما في ذلك النشاط ALDH، وتستخدم جانب السكان (SP) النمط الظاهري، والقدرة تشكيل كروي وtumorigenicity لعزل وتوصيف هذا شبه السكان الخلايا الجذعية السرطانية. CD44، وهو بروتين سكري سطح الخلية، وتشارك في التصاق الخلية والهجرة. وأعرب عن CD44 للغاية في كثير من الأورام الصلبة الخلايا الجذعية السرطانية 28، بما في ذلك سرطان الرأس والعنق نماذج 29-31. وعلاوة على ذلك، يمكن CD44 الخلايا عالية تولد في الجسم الحي الورم غير المتجانسة في حين الخلايا منخفضة CD44 لا يمكن 10. ويستند مقايسة SP على إمكانات التفاضلية من الخلايا لهروب رأس المال الصبغة هويشت 22 عن طريق الأسرة كاسيت ملزمة ATP (ABC) من البروتينات نقل overexpressed داخل غشاء ديوان الخدمة المدنية. ويشمل هذا الاختبار استخدام مثبطات نقل ABC مثل فيراباميل في عينات السيطرة. ألدهيد نازعة (ALDH) هو انزيم الخلايا التي تشارك في تحويل الريتينول إلى المتقاعدحمض inoic خلال الجذعية في وقت مبكر تمايز الخلايا 25،26. الخلايا التي تظهر ارتفاع ALDH عرض النشاط سلوك الخلية مثل الجذعية في HNSCC 26 وعدد قليل جدا من خلايا عالية ALDH قادرة على توليد أورام في الجسم الحي 26،32.
تم استخدام مزيج من هذه العلامات والخصائص بنجاح من قبل برتراند ه ر ال. لدراسة المقاومة في التجارب المختبرية والحية من هذه الخلايا الجذعية السرطانية إلى الفوتون والإشعاع 19 أيون الكربون. وأظهرت نتائجها بوضوح أن الجمع بين مختلف علامات الخلية وخصائص أكثر انتقائية للدراسات مفيدة على السكان HNSCC الخلايا الجذعية السرطانية من النهج علامة واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة يمكن الاعتماد عليها لعزل الخلايا الجذعية السرطانية ناجحة من خط خلية معينة أن تنطبق على خطوط الخلايا HNSCC أخرى. معزولة الخلايا الجذعية السرطانية في الرأس والرقبة ثم يتم مناسبة لمزيد من التوصيف الجزيئي في المختبر، والتحقق من صحة وظيفية من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells — Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells — Normal stem cells ‘Jedi’ that went over to the ‘dark side.’. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma–derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. . Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
