머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

두경부 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 진행에 대한 이해의 진보에도 불구하고, 5 년 생존율 인해 국소 재발 및 원격 전이 낮은 유지된다. 이러한 재발을 설명하기위한 하나의 가설은 고유의 화학 치료 및 전파 저항을 제시 암 줄기 유사 세포 (CSC 추가)의 존재이다. 새로운 치료 전략을 개발하기 위하여, 표적 치료의 효과를 검증 실험 모델을 가지고 있으므로 된 CSC의 동정 및 분리를위한 신뢰성있는 방법이 필요하다. 이를 위해 정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 수행되는 연속 된 두 셀 sortings (FACS)의 조합에 의존 HNSCC 인간 세포주에서 CSC 추가의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 첫 번째는 다른 사람의 사이에서 제외 따라서 카세트 (ABC) 트랜스 포터 단백질을 ATP가-바인딩 및 과발현하는 암줄 기세포의 특성을 기반으로, 같은 헥스 33342. 세포 같은 중요한 DNA 염료 번째로 정렬방법은 "측면 인구"(SP)로 식별됩니다. SP에 세포가 낮은 비율 부​​모 세포 (<5 %)을 나타내는 바와 같이, 성장 단계는 제 2 셀 정렬 전에 수를 증가시키기 위해 필요하다. 다음 단계는 두 HNSCC 줄기 세포 특성은 세포 표면 마커 CD44 ^(고 CD44) 및 알데히드 탈수소 효소의 과발현 (ALDH ^높음)의 높은 발현 수준을, 즉 보유 세포의 선택을 허용한다. 단일 마커의 사용 된 CSC, SP의 조합의 분리 수많은 제한 및 함정을 갖기 때문에, CD44 및 ALDH 마커는 생존 세포를 필요로 상기 분석 및 기능 분석을위한 된 CSC를 분리하는 유용한 도구를 제공 할 것이다. 암줄 기세포의 줄기 같은 특성은 마지막으로 tumorispheres의 형성과 β-catenin의 발현에 의해 시험 관내에서 확인되었다.

Introduction

머리와 목 편평​​ 세포 암 (HNSCC)는 전 세계 공통의 악성 종양이며, 현재 치료의 발전에도 불구하고, 고급 질환 환자는 예후가있다. 환자의 전체 5 년 생존율은 수술, 화학 – 방사선 요법 – 및 대상을 포함한 치료 적 접근법의 조합에도 불구하고 약 30 %이다. 최근의 연구는 항암 치료 ^한 다음 암 줄기 같은 세포의 생존 (암줄 기세포)에 국소 재발과 원격 전이 때문이다. 유방, 뇌, 전립선, 폐, 결장, 췌장, 간, 피부 ^2- 등 다양한 고형 종양 줄기 세포 특성 (미분화 상태,자가 재생과 분화 능력 및 텔로 머라 제 활성)을 제시 세포의 존재를지지 축적 증거가있다 ^10. 그러나, 암줄 기세포의 기원은 ^{11, 12} 불분명 남아 있습니다. 그들은 정상적인 줄기 세포 ^3,13 또는 dedifferen의 악성 변환으로 인해 발생할 수있는암줄 기세포와 같은 기능 ^{14, 15를} 취득 종양 세포의 tiation. 따라서 암줄 기세포에 관한 독특한 경로를 이해하는 것은 조기 진단과 저항 HNSCC의 치료에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.

된 CSC는 종양 세포 ^16-19의 부피에 비해 종양의 재발을 초래 표준 화학 요법과 방사선 치료를 회피 내성 표현형을 ^{갖고, 20} 틈새 저산소에 지역화 된 것이 제안되어왔다. 다양한 요소 그러한 정지 성향 등 CSC 추가의 저항이, 강화 된 DNA 수리, 상향 조절 세포주기 제어 메커니즘 및 자유 라디칼 소거능 ^(21)을 설명하기 위해 제안되었다. 또한, 여러 가지 종양의 분자 경로 구체적 된 CSC ^(17)에서 활성화 될 수있다. 또한 대상-치료를위한 암줄 기세포의 지식을 개선하기 위해, 우리는 줄기 세포 관련 마커의 이질성에 때문에, 식별 및 암줄 기세포의 분리를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다암 ^(22)의 다양한 종류.

HNSCC에서, 줄기 등을 종양 시작 세포와 같은 약물 유출 컨베이어 식 ^(23), CD44 ^높은, CD24 ^낮은 CD133 ^고, C-메트로 ^{+ 10, 24을} 표현형으로 다른 CSC의 바이오 마커를 (발현하는 세포를 정렬하여 주 환자의 종양에서 고립 ^{된, 25,} 또는 ALDH ^{활성이 높은 26)} 또는 CSC 속성이 squamospheres을 형성하는 주요 환자의 종양 양성. 그럼에도 squamospheres의 개수는 따라서 더 특성화 작은 샘플 크기 ^(27)을 연구주는 두 통로 후 급격히 감소한다. 따라서, 생체 외 분석이 잘 확립 된 세포주로부터 시작하는 CSC 추가의 기술을 개선하기 위해 실험을 설계하기 쉬운 해결책이다.

이 문서의 목적은 multiparametric 유세포 분석 A를 사용 HNSCC 세포주에서 암줄 기세포를 분리하는 방법을 제안하는 것이다차 셀 정렬. ALDH 활동 등 여러 암줄 기세포의 특성과의 상관 관계에서 CD44의 발현은, 사이드 인구 (SP) 표현형, 회전 타원체 형성 능력과 발암는 분리와 암줄 기세포의이 하위 집단의 특성을하는 데 사용됩니다. CD44, 세포 표면 당 단백질은 세포 부착 및 이동에 관여한다. CD44은 매우 머리와 목 암 모델 ^29-31에 포함 암줄 기세포 ⁽²⁸⁾ 많은 고형 종양으로 표현된다. 또한, CD44 ^높은 세포는 ¹⁰ 수없는 생체 내에서 CD44 ^낮은 세포 반면, 이종 종양을 생성 할 수 있습니다. SP는 분석은 CSC 내에 과발현 막 수송 단백질의 ATP 결합 카세트 (ABC)를 통해 가정 훽스트 염료 ^22를 유출하는 세포의 미분 가능성에 기초한다. 이 분석은 대조 시료에서 베라파밀로 ABC 트랜스 포터 억제제의 사용을 포함한다. 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)는 마지막 ret 레티놀 변환에 관여하는 세포 내 효소초기 줄기 세포 분화 ^{25, 26시} inoic 산. 높은 ALDH 활동 쇼 HNSCC ^(26)의 줄기와 같은 세포의 행동과 ALDH ^높은 세포의 매우 적은 수를 나타내는 세포는 생체 내 ^26,32에 종양을 생성 할 수 있습니다.

이러한 마커 및 속성의 조합이 성공적으로 베르트랑 전자 t의 알에 의해 사용되었다. 시험관 내에서 광자하려면 다음 암줄 기세포의 생체 내 탄소 이온 방사선 ^(19)의 저항을 연구. 그들의 결과는 명확하게 다양한 세포 마커 및 속성의 조합이 단일 마커 방법보다 HNSCC 암줄 기세포 집단에 대한 유용한 연구를위한 더 선택적인 것으로 나타났다.

Protocol

모든 동물 절차는 동물 보호의 로컬 가이드 라인에 따라 수행 하였다. 이 연구의 모든 세부 사항은 CECCAPP, 프랑스 윤리위원회에 의해 승인되었다. 훽스트 (Hoechst) 염료 유출 분석에 의한 측면 인구 (SP) 1. 선택 훽스트 33342 염료로 5 천만 세포를 염색. 한 "훽스트 (Hoechst)"라는 레이블이 붙은 튜브와 "훽스트 및 베라파밀"로 표시 한 두 개의 15 ml의에게 원뿔 바닥…

Representative Results

HNSCC 셀 라인에서 암줄 기세포의 분리 때문에 부모 세포주에서 암줄 기세포의 매우 낮은 비율의 두 개의 연속 정렬이 필요합니다. 첫 번째 분류는 약물 유출 수송에 의한 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 할 암줄 기세포의 능력에 근거했다. 이 분류 전체 세포 인구 (그림 1) 1-5 %를 인수 결과. 의 Hoechst 염색 부정적인 셀 정렬하는 동안, SSC-A 도트 플롯 (그림 1A)</s…

Discussion

이 프로토콜은 다른 HNSCC 세포주에 적용되는 특정 세포주에서 CSC 추가의 성공적인 분리를위한 신뢰성있는 방법을 설명한다. 격리 된 머리와 목 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스 ^(19)에 이식하여 체외 및 기능 검증에 더 분자 특성화 다음에 적합하다. 그러나 일부 수정 측면 인구 또는 부모 세포주에 존재하는 CD44 ^고 / ALDH ^높은 비율에 따라 테스트 할 수 있습니?…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–