Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

Trotz der Fortschritte im Verständnis von Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome (HNSCC) Progression, die Fünf-Jahres-Überlebensrate niedrig bleibt aufgrund der lokalen Rezidiven und Fernmetastasen. Eine Hypothese diese Wiederholung zu erklären, ist das Vorhandensein von Krebs stielartigen Zellen (CSCs), die mit inhärenten Chemo- und Radioresistenz vor. Um neue therapeutische Strategien zu entwickeln, ist es notwendig, experimentelle Modelle zu haben, die die Wirksamkeit von gezielten Behandlungen zu validieren und somit zuverlässige Methoden zur Identifizierung und Isolierung von CSCs zu haben. Zu diesem Zweck stellen wir ein Protokoll für die Isolierung des CSCS aus humanen HNSCC Zelllinien, die auf der Kombination von zwei aufeinanderfolgenden Zell Sortierungen durchgeführt durch Fluoreszenz-aktivierte Zell beruht Sortierung (FACS). Die erste ist auf dem Grundstück von CSCs basiert überexprimiert ATP-Binding Cassette (ABC) Transporterproteine ​​und damit ausschließen, unter anderem lebenswichtige DNA-Farbstoffe wie Hoechst 33342. Die Zellen mit th sortiertwird Verfahren werden als "Side Population" (SP) identifiziert. Da die SP-Zellen einen geringen Anteil (<5%) der parentalen Zellen darstellen, eine Wachstumsphase erforderlich, um ihre Anzahl vor dem zweiten Zellsortierung zu erhöhen. Der nächste Schritt ermöglicht die Selektion von Zellen , die zwei anderen HNSCC Stammzelleigenschaften wie zB hohe Expressionsniveau der Zelloberflächenmarker CD44 (CD44 ^hoch) und die Überexpression von Aldehyd – Dehydrogenase (ALDH ^hoch) besitzen. Da die Verwendung eines einzigen Marker zahlreiche Einschränkungen und Gefahren für die Isolierung von CSCs hat, liefert die Kombination von SP, CD44 und ALDH-Marker ein nützliches Werkzeug, um CSCs für weitere analytische und funktionelle Assays erfordern lebenden Zellen zu isolieren. Die stielartigen Eigenschaften des CSCS wurde schließlich in vitro durch die Bildung von tumorispheres und die Expression von β-Catenin validiert.

Introduction

Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist eine häufige Malignität weltweit und trotz der Fortschritte bei laufenden Behandlungen, Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung haben eine schlechte Prognose. Die insgesamt 5-Jahres-Überlebensrate des Patienten liegt bei etwa 30% trotz der Kombination von therapeutischen Ansätzen, einschließlich der Operation, Chemo-Strahlentherapie und gezielte-Therapien. Jüngste Studien Attribut Lokalrezidiv und Fernmetastasen auf das Überleben von Krebsstielartigen Zellen (CSCs) im Anschluss an Anti – Krebs – Therapien ^1. Es gibt vermehrt Beweise für die Existenz von präsentierenden Zellen Stammzellen Eigenschaften (undifferenzierten Status, Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazitäten und Telomerase – Aktivität) in verschiedenen soliden Tumoren wie Brust-, Hirn-, Prostata-, Lungen-, Dickdarm-, Pankreas, Leber und Haut unterstützen ^{2- 10.} Jedoch bleibt der Ursprung des CSCS unklar ^11,12. Sie können sich von der malignen Transformation von normalen Stammzellen ^3,13 oder dedifferen führenhandlungen von Tumorzellen , die ^14,15 CSCs-ähnliche Funktionen zu erwerben. Daher unverwechselbare Wege Verständnis zu CSCs Zusammenhang wird Einblick in die frühe Diagnose und Behandlung von resistenten HNSCC bieten.

Es wurde vorgeschlagen , dass CSCs auch resistent Phänotypen besitzen , die Standard – Chemotherapie und Strahlentherapie entziehen, was zu einer Tumorrückfall im Vergleich zu der Masse der Tumorzellen ^16-19 und sind lokalisiert in hypoxischen Nischen ^20. Zahlreiche Faktoren haben diese Widerstände von CSCs, wie Neigung zur Ruhe, erhöhte DNA – Reparatur, hochreguliert Zellzyklus – Kontrollmechanismen und Radikalfänger ²¹ zu erklären vorgeschlagen. Darüber hinaus können mehrere onkogene molekularen Wege speziell in CSCs ¹⁷ aktiviert werden. Um weitere gezielte-Therapien Wissen von CSCs zu verbessern, brauchen wir zuverlässige Methoden zur Identifizierung und Isolierung von CSCs, ist wegen der Heterogenität der Stammzellbezogenen Marker inverschiedene Arten von Krebserkrankungen ^22.

In HNSCC, stielartigen Tumor-initiierenden Zellen von primären Patienten Tumoren isoliert wurden durch Zellen, die unterschiedliche CSC – Biomarker (wie Drogen Efflux – Transporter Ausdruck ^23, CD44 ^hoch, CD24 ^niedrig CD133 ^hoch, c-Met ⁺ Phänotyp ^{10,24 Sortierung, 25} oder ALDH ^hohe Aktivität ²⁶⁾ oder primären Patiententumor Kultivierung squamospheres zu bilden , die CSC – Eigenschaften haben. Dennoch nimmt die Anzahl der squamospheres dramatisch nach zwei Durchgängen, so dass eine kleine Stichprobengröße für die weitere Charakterisierung geben ²⁷ studiert. Daher werden in – vitro – Assays von etablierten Zelllinien beginnt , ist eine einfachere Lösung Experimente zu entwerfen , um Wissen von CSCs zu verbessern.

Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren vorzuschlagen CSCs von HNSCC Zelllinien multiparametrischer durchflusszytometrische Analyse ein zu isolierennd Zellsortierung. Die Expression von CD44 in Korrelation mit mehreren CSCs Eigenschaften einschließlich ALDH-Aktivität, Side Population (SP) Phänotyp, sind Sphäroidformation Fähigkeit und tumorigenicity verwendet, um dieses Subpopulation von CSCs zu isolieren und zu charakterisieren. CD44 ist ein Zelloberflächen-Glycoprotein, ist in der Zelladhäsion und Migration beteiligt. CD44 wird in hohem Grade in vielen soliden Tumoren CSCs ²⁸ ausgedrückt, auch in Kopf- und Halskrebs Modelle ^29-31. Darüber hinaus können CD44 ^hohe Zellen in vivo einen heterogenen Tumor während CD44 ^niedrigen Zellen erzeugen kann nicht ^10. Der SP – Test wird auf dem Differenzpotential von Zellen auf der Basis des Hoechst – Farbstoff ²² über die ATP-bindenden Kassette (ABC) Familie von Transporterproteine ​​überexprimiert in der CSC – Membran zu Ausströmen. Dieser Test umfasst die Verwendung von ABC-Transporter-Inhibitoren wie Verapamil in Kontrollproben. Aldehyddehydrogenase (ALDH) ist ein intrazelluläres Enzym, das bei der Umwandlung von Retinol beteiligt ist zu retinoic Säure während der frühen Differenzierung von Stammzellen ^25,26. Die Zellen , die hohe ALDH Aktivität zeigen stielartigen Zellverhalten in HNSCC ²⁶ und eine sehr geringe Anzahl von ALDH ^hohe Zellen zeigen können Tumoren in vivo ^26,32 zu erzeugen.

Die Kombination dieser Marker und die Eigenschaften wurde erfolgreich von Bertrand e t al. , Den Widerstand in vitro zu untersuchen und in vivo dieser CSCs zu Photonen- und Kohlenstoffionenstrahlung ^19. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Kombination von verschiedenen Zellmarkern und Eigenschaften sind selektiver für nützliche Untersuchungen über HNSCC CSCs Populationen als single-Marker Ansätze.

Protocol

Alle Tier Verfahren wurden nach den örtlichen Richtlinien für die Tierpflege durchgeführt. Alle Details dieser Studie wurden von der CECCAPP genehmigt, eine Französisch Ethikkommission. 1. Auswahl eines Side Population (SP) von der Hoechst Dye Efflux Assay Das Anfärben 50 Millionen Zellen mit Hoechst 33342 Farbstoff. Bereiten zwei 15 ml sterile Röhrchen mit konischem Boden: ein Rohr mit "Hoechst" und eine Bezeichnung "Hoechst und Verapamil". Bereiten Sie 10 ml…

Representative Results

Die Isolierung von CSCs von HNSCC Zelllinien benötigt, um zwei aufeinanderfolgende Sortierung wegen des sehr geringen Anteil an CSCs in der elterlichen Zelllinie. Die erste Sortierung wurde auf die Fähigkeit von CSCs Basis des Hoechst-Farbstoff wegen Drogen Efflux-Transporter auszuschließen. Dies resultierte in Erwerb von 1-5% der Gesamtzellpopulation sortiert (Abbildung 1). Während der Hoechst – Farbstoff negativen Zellsortierung, überprüfen Sie die Größe und di…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die erfolgreiche Isolierung von CSCs aus einer bestimmten Zelllinie, die auf andere HNSCC Zelllinien anwendbar ist. Isolierte Kopf und Hals CSCs eignen sich dann für die weitere molekulare Charakterisierung in vitro und funktionale Validierung durch Transplantation in immundefizienten Mäusen ^19. Allerdings können einige Änderungen in Abhängigkeit von der Seiten Bevölkerung getestet werden oder die CD44 ^hoch / ALDH ^hohen…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–