Выделение и характеристика головы и шеи карцинома роговых клеток субпопуляции Имея стволовой клетки Характеристики
Summary
Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Abstract
Несмотря на достигнутые успехи в понимании головы и шеи плоскоклеточный рак (ПРГШ) прогрессирования, частота пятилетняя выживаемость остается низкой из-за местных рецидивов и отдаленных метастазов. Одна из гипотез для объяснения этого рецидива является наличие раковых стволовых клеток типа (CSC), которые представляют присущую хемо- и радиорезистентности. В целях разработки новых терапевтических стратегий, необходимо иметь экспериментальные модели, которые проверки эффективности целевых методов лечения и, следовательно, иметь надежные методы для идентификации и выделения ЦОК. С этой целью мы приводим протокол для выделения ЦОК из линий человеческих клеток ПРГШ, которая опирается на комбинации двух последовательных сортировок клеток, выполненных с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS). Первый из них основан на свойстве ЦОК к сверхэкспрессии АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеру белков и, таким образом, исключить, среди других, жизненно важных красителей ДНК, такие как Hoechst 33342. Клетки отсортирован нногоявляется метод идентифицируются как "побочный населения" (СП). По мере того как SP клетки представляют собой низкий процент (<5%) родительских клеток, растущая фаза необходима для того, чтобы увеличить их число до второй сортировки клеток. Следующий шаг позволяет для отбора клеток , которые обладают двумя другими характеристиками ПРГШ стволовых клеток , то есть высокий уровень экспрессии маркера клеточной поверхности CD44 (CD44 высокий) и избыточная экспрессия альдегиддегидрогеназой (ALDH высокий). Так как использование одного маркера имеет многочисленные ограничения и подводные камни для изоляции ЦОНов, сочетание SP, CD44 и маркеры ALDH обеспечит полезный инструмент для выделения CSCs для дальнейших аналитических и функциональных анализов, требующих жизнеспособных клеток. Стволовые подобные характеристики ЦОК была окончательно подтверждена в пробирке формирования tumorispheres и экспрессии бета-катенина.
Introduction
Голова и шея плоскоклеточный рак (ПРГШ) является распространенным злокачественным во всем мире и, несмотря на прогресс в современных методов лечения, у пациентов с прогрессирующим заболеванием имеют плохой прогноз. Общая 5-летняя выживаемость пациентов составляет около 30%, несмотря на сочетание терапевтических подходов, включая операции, химио-лучевой терапии и целевых-терапии. Недавние исследования объясняют местный рецидив и отдаленные метастазы для выживания раковых стволовых клеток типа (ОКК) после терапии противоопухолевыми 1. Существует накопления доказательств , подтверждающих существование клеток , представляющих стволовых клеток свойства (недифференцированные состояния, самообновлению и дифференцировке потенциала и активности теломеразы) в различных солидных опухолей , включая рак груди, мозга, простаты, легких, толстой кишки, поджелудочной железы, печени и кожи 2- 10. Тем не менее, происхождение ЦОК остается неясным 11,12. Они могут возникнуть в результате злокачественной трансформации нормальных стволовых клеток 3,13 или dedifferenференцирование опухолевых клеток , которые приобретают ОКК-подобные функции 14,15. Таким образом, понимание отличительных путей, связанных с ЦОК обеспечит понимание ранней диагностики и лечения резистентной ПРГШ.
Было высказано предположение , что ЦОК также обладают устойчивые фенотипы , которые уклоняются стандартной химиотерапии и лучевой терапии, что приводит к рецидиву опухоли по сравнению с основной массы опухолевых клеток и 16-19 локализованы в гипоксических ниши 20. Многочисленные факторы были предложены для объяснения этих сопротивлений ЦОК, такие как склонность к пассивности, усиливается репарации ДНК, повышающей регуляции механизмов контроля клеточного цикла, и свободных радикалов , поглощающие 21. Кроме того, несколько онкогенных молекулярные пути могут быть специфически активированы в ЦОК 17. В целях повышения знаний о ЦОК для дальнейших целенаправленных-терапии, нам нужны надежные методы для идентификации и выделения ЦОК, вследствие неоднородности маркеров стволовых клеток, связанных вразличные виды рака 22.
В ПРГШ, стволовой как опухолевые инициирующие клетки были выделены из первичных опухолей пациентов с помощью сортировки клеток , экспрессирующих различные биомаркеры КАН (такие как транспортеров выражение эффлюксного препарат 23, CD44, CD24 высокой низкой CD133 высокой, с-Met + фенотип 10,24, 25, или ALDH высокая активность 26) или культивирования первичной опухоли пациента с образованием squamospheres , которые имеют свойства CSC. Тем не менее, количество squamospheres резко уменьшается после двух пассажей, таким образом , давая небольшой размер выборки для дальнейшей характеристики исследования 27. Таким образом, в пробирке анализы , начиная от хорошо зарекомендовавших клеточных линий является простое решение для разработки экспериментов с целью улучшения знаний о ОКК.
Цель данной статьи состоит в том, чтобы предложить способ изолировать CSCs из линий ПРГШ клеток с использованием многопараметрической проточной цитометрии анализамй сортировки клеток. Выражение CD44 в корреляции с несколькими свойствами ОКК включая ALDH активности, со стороны населения (SP) фенотип, сфероид способность формирования и туморогенность используются, чтобы изолировать и охарактеризовать этот субпопуляции ЦОНов. CD44, клеточной поверхности гликопротеин, участвует в клеточной адгезии и миграции. CD44 экспрессируется на высоком уровне во многих солидных опухолях ЦОК 28, в том числе и в моделях рака головы и шеи 29-31. Кроме того, CD44 высокие клетки могут генерировать в естественных условиях гетерогенной опухоли , тогда как CD44 низкие клетки не могут 10. Анализ SP основана на дифференциальном потенциала клеток в оттоке красителя Hoechst 22 посредством семейства АТФ-связывающего кассетного (ABC) из белков – переносчиков избыточно экспрессируется в мембране CSC. Этот анализ включает в себя применение ингибиторов ABC-переносчиков, такие как верапамил в контрольных образцах. Альдегиддегидрогеназа (ALDH) является внутриклеточным ферментом, который участвует в превращении ретинол в РЭТinoic кислоты во время дифференцировки ранних стволовых клеток 25,26. Клетки , которые обладают высокой ALDH активность шоу стволовых клеток , как поведение в ПРГШ 26 и очень небольшое число ALDH высоких клеток способны генерировать опухоли в естественных условиях 26,32.
Сочетание этих маркеров и свойств был успешно использован Бертрана е т др. , Чтобы изучить сопротивление в пробирке и в естественных условиях этих ЦОК для фотонов и иона углерода излучения 19. Их результаты ясно показали, что сочетание различных маркеров и свойств клеток являются более селективными в отношении полезных исследований на популяции ПРГШ ОКК по сравнению с однократной маркерных подходов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает надежный метод успешного выделения ЦОК от конкретной клеточной линии, которая применима к другим линиям ПРГШ клеток. Изолированные ОКК головы и шеи затем пригодны для дальнейшей молекулярной характеристики в пробирке и функциональной проверки путем тран…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells — Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells — Normal stem cells ‘Jedi’ that went over to the ‘dark side.’. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma–derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. . Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
