Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

Apesar dos avanços na compreensão da cabeça e pescoço progressão carcinomas de células escamosas (CECP), a taxa de sobrevivência de cinco anos permanece baixa devido à recorrência local e metástases à distância. Uma hipótese para explicar esta recorrência é a presença de câncer de células estaminais-like (CSCs) que apresentam quimioterapia inerente e radio-resistência. A fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas, é necessário dispor de modelos experimentais que validam a eficácia dos tratamentos específicos e, por conseguinte, dispor de métodos fiáveis ​​para a identificação e isolamento das CSCs. Para este fim, é apresentado um protocolo para o isolamento de linhas CSCs de células de carcinoma epidermóide humano que assenta na combinação de duas células sucessivas ordenações realizadas por células activadas por fluorescência (FACS). O primeiro é baseado na propriedade de CSCs para superexpressão ATP de Ligação a cassete (ABC) proteínas transportadoras e, portanto, excluir, entre outros, corantes de ADN vitais como a Hoechst 33342. As células classificadas com thé método são identificados como um "side population" (SP). À medida que as células SP representa uma percentagem baixa (<5%) de células parentais, uma fase de crescimento é necessária, a fim de aumentar o seu número, antes da segunda separação de células. O próximo passo permite a selecção de células que possuem outras duas características de células estaminais HNSCC ie alto nível do marcador da superfície celular CD44 (CD44 ^alto) e o-expressão através de aldeído desidrogenase (ALDH ^alta) expressão. Uma vez que a utilização de um único marcador tem numerosas limitações e armadilhas para o isolamento de CSCs, a combinação de SP, CD44 e marcadores ALDH fornecerá uma ferramenta útil para isolar CSCs para mais ensaios analíticos e funcionais que necessitam de células viáveis. As características estaminais semelhante de CSCs finalmente foi validado in vitro pela formação de tumorispheres e a expressão de β-catenina.

Introduction

carcinoma da cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) é um tumor maligno comum em todo o mundo e apesar dos progressos em tratamentos atuais, os pacientes com doença avançada têm um mau prognóstico. A taxa de sobrevivência de cinco anos geral do paciente é de cerca de 30%, apesar da combinação de abordagens terapêuticas, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia-segmentados terapias. Estudos recentes atribuem recorrência local e metástases à distância para a sobrevivência de câncer de células estaminais-like (CSCs) após terapias anticâncer ^1. Existem provas acumuladas de apoiar a existência de células que apresentam propriedades de células estaminais (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovação e diferenciação e actividade de telomerase) em diversos tumores sólidos incluindo cancro da mama, do cérebro, da próstata, do pulmão, do cólon, do pâncreas, do fígado e da pele ^{2- 10.} No entanto, a origem de CSCs permanece obscuro ^11,12. Eles podem resultar da transformação maligna de células-tronco normais ^3,13 ou dedifferenciação de células tumorais que adquirem CSCs-como características ^14,15. Portanto, a compreensão percursos distintos relacionados com CSCs irá fornecer informações sobre diagnóstico e tratamento de HNSCC resistentes cedo.

Tem sido proposto que os CSCs também possuem fenótipos resistentes que contornam a quimioterapia e radioterapia padrão, resultando em recidiva tumoral em comparação com a maior parte das células tumorais ^16-19 e estão localizadas em nichos ²⁰ hipóxico. Numerosos factores têm sido propostos para explicar estas resistências de CSCs, tais como a propensão para a quiescência, reparação melhorada de ADN, sobre-regulada mecanismos de controlo do ciclo celular, e de eliminação de radicais livres ^21. Além disso, várias vias moleculares oncogénicos podem ser especificamente activado em CSCs ^17. A fim de melhorar o conhecimento dos CSCs para-terapias-alvo ainda mais, precisamos de métodos confiáveis ​​para a identificação e isolamento de CSCs, devido à heterogeneidade dos marcadores relacionados com células-tronco emvários tipos de cânceres ^22.

Em HNSCC, caule-como células de iniciação do tumor foram isoladas a partir de tumores primários do paciente por células que expressam diferentes biomarcadores CSC (tais como transportadores de efluxo de drogas expressão ^23, CD44 ^alto, CD24 ^low CD133 ^alta, c-Met ⁺ fenótipo ^{10,24 triagem, 25,} ou ^{uma elevada} actividade de ALDH ²⁶⁾ ou cultivar tumor primário paciente para formar squamospheres que têm propriedades CSC. No entanto, o número de squamospheres diminui dramaticamente após duas passagens, proporcionando, assim, um pequeno tamanho de amostra para caracterização adicional ²⁷ estuda. Portanto, ensaios in vitro a partir de linhas celulares bem estabelecidas é uma solução mais fácil para projetar experiências, a fim de melhorar o conhecimento dos CSCs.

O objetivo deste artigo é propor um método para isolar CSCs de linhas celulares CECP usando citometria de fluxo multiparamétrica análise de umnd separação de células. A expressão de CD44 em correlação com várias propriedades, incluindo a actividade de ALDH CSCs, lateral População (SP) fenótipo, a capacidade de formação de esferóides e tumorigenicidade são usados ​​para isolar e caracterizar esta sub-população de CCC. CD44, uma glicoproteína de superfície celular, está envolvido na adesão celular e migração. CD44 é altamente expressa em muitos tumores sólidos CSCs ^28, inclusive em modelos de câncer de cabeça e pescoço ^29-31. Além disso, células de ^alta CD44 pode gerar in vivo um tumor heterogêneo enquanto que as células CD44 ^baixas não pode ^10. O ensaio SP baseia-se na diferença de potencial das células ef luxar o corante Hoechst ²² através da família de cassete de ligação a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobre-expressas na membrana CSC. Este ensaio inclui o uso de inibidores de transportadores ABC tais como verapamil em amostras de controlo. Aldeído desidrogenase (ALDH) é uma enzima intracelular que está envolvido na conversão de retinol para retácido inoic durante a diferenciação de células-tronco cedo ^25,26. As células que exibem um comportamento de alta ALDH atividade show de haste-como células em HNSCC ²⁶ e um número muito poucos de células de ^alta ALDH são capazes de gerar tumores in vivo ^26,32.

A combinação destes marcadores e propriedades foi utilizada com sucesso por Bertrand e t al., Para estudar a resistência in vitro e in vivo destes CSCs de fotões e de iões de carbono radiação ^19. Os resultados mostraram claramente que a combinação de vários marcadores de células e propriedades são mais seletivos para estudos úteis sobre as populações HNSCC CSCs do que as abordagens-marcador único.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes locais sobre cuidados com animais. Todos os detalhes deste estudo foram aprovados pelo CECCAPP, uma comissão de ética francesa. 1. Selecção de uma População lateral (SP) pelo corante Hoechst efluxo Ensaio A coloração 50 milhões de células com corante Hoechst 33342. Preparar dois tubos de 15 ml estéreis com um fundo cônico: um tubo rotulado "Hoechst" e um marcado "Hoechst e Verapam…

Representative Results

O isolamento de CSCs de linhas celulares CECP necessários dois triagem sucessiva por causa da percentagem muito baixa de CSCs na linha de células parental. A primeira classificação baseou-se na capacidade das CSCs de excluir o corante Hoechst devido a transportadores de efluxo de drogas. Isto resultou na aquisição de 1-5% da população total de células classificadas (Figura 1). Durante a separação de células negativa Hoechst corante, verifique o tamanho e gran…

Discussion

Este protocolo descreve um método de confiança para o isolamento bem sucedido de CSCs a partir de uma linha celular específica, que é aplicável a outras linhas de células de carcinoma epidermóide. CSCs de cabeça e pescoço isoladas são então adequado para posterior caracterização molecular in vitro e validação funcional por transplante em ratinhos imunodeficientes ^19. No entanto, algumas modificações podem ser testados de acordo com a população CD44 lado ou os ^alta / ALDH…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–