<em> Ex Vivo</em> Культура и Pattern Recognition Рецептор Стимуляция мыши Кишечные органоидами
Summary
Здесь, протокол для сбора, сохранения и лечения тонкого кишечника мыши органоиды патогена связаны молекулярных моделей (PAMPs) и листерий описывается, а также акцент на экспрессию генов и надлежащих методов нормализации для белка.
Abstract
Первичные кишечные органоиды являются ценным модель системы, которая имеет потенциал, чтобы существенно повлиять на поле через слизистую оболочку иммунология. Тем не менее, сложность в Органоид характеристики роста несут значительные предостережений для исследователя. В частности, закономерности роста каждого отдельного Органоид весьма разнообразны и создают гетерогенную популяцию эпителиальных клеток в культуре. С помощью таких предостережений, общие ткани практики культуры не могут быть просто применены к Органоид системе из-за сложности клеточной структуры. Подсчет и металлизированный исключительно на основе числа клеток, который является общим для индивидуально разделенных клеток, таких как клеточные линии, не является надежным методом органоидов, если не применяется какой-то метод нормализации. Нормализация к общему содержанию белка выполнен комплекс благодаря матрице резидентного белка. Эти характеристики с точки зрения количества клеток, формы и типа клеток следует принимать во внимание при оценке секретируемый CONпалатки от Органоид массы. Этот протокол был сформирован, чтобы наметить простую процедуру для культуры и лечения тонкого кишечника с органоиды микробных патогенов и патогенных микроорганизмов, связанные молекулярных моделей (PAMPs). В нем также подчеркивается методы нормализации, которые должны применяться при анализе белка проводится после такого вызова.
Introduction
Способность собирать и культуры первичных органоиды были описаны для тонкой кишки, толстой кишки, поджелудочной железы, печени и головного мозга и захватывающие достижения релевантно для понимания более физиологически представительный явления для тканевой биологии 1-5. Первые методы , характеризующие культуру и поддержания тонкого кишечника органоидами сообщает Сато и др. Из лаборатории Ганса Clevers 1. До этого метода, сбора и культуры первичных эпителиальных клеток кишечника оказалась ограниченной и неэффективной в поддержании эпителиальной роста клеток. Методы включали диссоциацию ткани с помощью инкубации с ферментами, такими как коллагеназы и диспазу, которые в конечном итоге привести к вырост перемешанных первичных клеток фибробластов 6. Эти условия также будут ограничены время в поддержании эпителиальной клеточной культуры. Минимальное чтобы не эпителиальной клетки ниши будет формироваться, как эпителиальные клетки вступит апоптоз из-заотсутствие соответствующих факторов роста или потери целостности контактов, называется anokis 7. Появление 3D-Органоид системы культуры предложен способ культивирования первичных клеток кишечника , содержащих спектр кишечных типов клеток в культуре устойчивой 1. Эти эпителиальные органоиды имеют преимущества по сравнению с клеточными линиями в том , что они состоят из нескольких дифференцированных клеток, и лучше имитировать орган они получены из 8 в естественных условиях. Процесс в конечном счете, "вырастить мини-кишка в блюде" оказалась ценным инструментом для оценки реакции кишечного эпителия при различных раздражителей. Исследуя взаимодействие первичных клеток кишечника с микробным патогенам связаны молекулярных моделей (PAMPs) имеет отношение к области иммунологии , как эти молекулярные структуры могут регулировать различные ответы от хозяина и микроба 9. Мало того, что исследователи в настоящее время исследовать эти взаимодействия с органоидами мыши, но онимогут быть выращены от людей , а также 2. Эта технология имеет потенциал, чтобы резко изменить персонализированной медицины и заманчиво порассуждать о достижениях, что этот метод даст возможность в ближайшем будущем.
Общая цель этого метода заключается в создании протокола для культуры, расширение и лечение кишечных органоидами с различными стимулами. Такие стимулы могут в конечном счете, в диапазоне от вакцин, бактериальных PAMPs, живых патогенных микроорганизмов, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и терапии рака. Выделение и культура мыши кишечных органоидами была заимствована из Сато и др. Хотя есть небольшие отклонения от первоначального способа, конечный продукт является Органоид культура все еще достигается , когда после этого протокола. Этот метод ориентирован на описании адекватную методику для правильной нормализации при работе с неоднородных клеточных структур, которые должны быть приняты во внимание при проведении анализа на основе клеток пхариус.
Protocol
Representative Results
Discussion
Культура и содержание кишечных органоидами является процедурой, которая может быть освоена любым человеком с адекватной техникой тканевой культуры. Есть тонкости в пересева, когда по сравнению с выращивания клеток в более традиционных монослоя, но эти тонкости не трудно преодолеть. К…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. . Culture of epithelial cells. 2nd edn. , (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
