그만큼<em> 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의> 문화 및 패턴 인식 수용체 자극
Summary
여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.
Abstract
기본 장 organoids 크게 점막 면역학 분야에 영향을 미칠 수있는 유용한 모델 시스템이다. 그러나, organoid 성장 특성의 복잡성은 연구자에 대한 상당한주의를 실시하고 있습니다. 특히, 각각의 organoid의 성장 패턴은 매우 다양하며, 문화 상피 세포의 이종 인구를 만듭니다. 이러한주의 사항과 함께, 일반 조직 배양 방법은 단순히 의한 세포 구조의 복잡성으로 organoid 시스템에 적용 할 수 없다. 일부 정규화 기술을 적용하지 않는 계산 및 세포주 개별적으로 분리 된 셀에 대해 공통 셀 번호만을 기준 도금 organoids위한 신뢰할 수있는 방법이 아니다. 총 단백질 함량 정규화 때문에 거주자 단백질 매트릭스 복합체 이루어진다. 분비 된 콘을 평가할 때 세포 수, 형상 및 세포 형태 측면에서 이러한 특성은 고려되어야organoid 질량에서 텐트. 이 프로토콜은 문화 간단한 절차를 간략하게 설명하고 미생물 병원체 및 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)에 소장 organoids을 치료하기 위해 생성되었습니다. 또한 단백질 분석은 이러한 공격 후 수행 할 때 적용해야 정규화 기술을 강조한다.
Introduction
능력은 수확과 문화 차 organoids 조직 생물학 1-5에 대한보다 생리 학적으로 대표 현상을 이해하는 데 밀접한 흥미로운 발전 소장, 대장, 췌장, 간, 뇌에 대해 설명하고 있습니다되었습니다. 소장 organoids의 문화 및 유지 보수를 설명하는 첫 번째 방법은 사토 등의 알에 의해보고되었다. 한스 Clevers 1의 실험실에서. 이 방법, 수확 및 입증 차 장 상피 세포의 배양에 앞서 제한 상피 세포 성장 유지에 효과가있다. 방법은 궁극적으로 혼합 차 섬유 아세포 (6)의 부산물로 이어질 것 같은 콜라게나 제와 디스 파제 등의 효소와 함께 배양을 통해 조직의 분리를 포함했다. 이러한 조건은 또한 시간은 상피 세포 배양을 지속 제한 될 것이다. 상피 세포로 인해 세포 사멸을 입력으로 더 상피 세포 틈새에 최소가 형성 것적절한 성장 인자 또는 접촉 무결성 손실의 부족 anokis 7 불린다. 입체 · organoid 배양 시스템의 출현은 지속적인 배양 한 장내 세포 유형의 스펙트럼을 포함하는 일차 배양 장 세포에 대한 방법을 제공했다. 이러한 상피 organoids들은 여러 분화 세포로 구성되어 있음되는 세포주에 비해 많은 장점을 가지고, 그들이보다 생체 8로부터 유도 된 기관을 모방. 과정은 결국 다른 자극 하에서 장내 상피 세포의 반응을 평가하기위한 가치있는 도구임이 입증되었다 "접시 미니 창자 성장"한다. 이러한 고분자 패턴은 호스트와 미생물 9 모두에서 다양한 반응을 조절할 수있는 미생물 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)와 기본 장 세포의 상호 작용을 조사하는 면역학 분야에 적합하다. 뿐만 아니라 연구자들은 이제 마우스 organoids 이러한 상호 작용을 탐구하지만, 수물론이 같은 사람에서 배양 할 수있다. 이 기술은 극적 맞춤 의약품을 변경할 가능성을 가지고 있으며,이 기술은 가까운 미래에 가능하게하는 것으로 추측 발전 유혹된다.
이 방법의 전체 목표는 다양한 자극과 함께 배양 확장을위한 프로토콜 및 장내 organoids의 치료를 제공하는 것이다. 이러한 자극은 백신, 세균 PAMPs가, 살아있는 병원균, 위장관 (GI) 및 암 치료제에서 궁극적으로 범위 수 있습니다. 마우스 장 organoids의 분리 및 배양 사토 등의 알에서 적응하고있다.이 프로토콜을 다음과 같은 경우, 최종 제품은 문화 organoid되는 것은 여전히 달성 원래의 방법에서 약간의 편차가 있지만. 이 방법은 세포, N에 기초하여 분석을 수행 할 때 고려되어야 비 균일 한 셀 구조, 작업시 적절한 정규화를위한 적절한 기술을 설명하기에 집중엄버.
Protocol
Representative Results
Discussion
장 organoids의 문화 및 유지 보수 적절한 조직 배양 기술로 개별 마스터 할 수있는 절차입니다. 이보다 기존의 단일 층의 세포 성장에 비해 계대에 미묘한가 있지만, 이러한 미묘한 차이는 극복하기 어려운되지 않습니다. 이 방법의 중요한 단계는 최적의 파종을 위해 충분히 높은 밀도로 organoids 성장을 할 수있는 포함한다. 통상적으로 세포주를 달성 할 수있다 큰 파종 밀도가 실질적으로없는 실험 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
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