o<em> Ex Vivo</em> Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides
Summary
Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.
Abstract
Organóides intestinais primárias são um sistema modelo valioso que tem o potencial para impactar significativamente o campo da imunologia da mucosa. No entanto, as complexidades das características de crescimento organ�de realizar ressalvas significativas para o investigador. Especificamente, os padrões de crescimento de cada organ�de indivíduo são altamente variáveis e criar uma população heterogénea de células epiteliais em cultura. Com estas advertências, práticas de cultura de tecido comum não pode ser simplesmente aplicada ao sistema organ�de devido à complexidade da estrutura celular. Contando e revestimento com base exclusivamente no número de células, o que é comum para as células separadas individualmente, como as linhas de células, não é um método fiável para Organóides a menos que alguma técnica de normalização é aplicada. Normalizando para o conteúdo de proteína total é feita complexa devido à matriz proteica residente. Essas características, em termos de número de células, forma e tipo de célula devem ser levados em consideração ao avaliar con secretadatendas de massa organ�de. Este protocolo foi gerado para delinear um procedimento simples para a cultura e tratar pequenos Organóides intestinais com patógenos microbianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Ele também enfatiza as técnicas de normalização que deve ser aplicado quando a análise de proteínas são conduzidas depois de um tal desafio.
Introduction
A capacidade de colher e Organóides cultura primária foram descritas para intestino delgado, cólon, pâncreas, fígado e cérebro e são avanços excitantes germano para entender um fenômeno mais fisiologicamente representante para a biologia do tecido 1-5. Os primeiros métodos que descrevem a cultura e manutenção de pequenas Organóides intestinal foi relatado por Sato et al. Para fora do laboratório de Hans Clevers 1. Antes deste método, e a colheita da cultura de células epiteliais intestinais primários mostrou-se limitado e ineficaz na sustentação do crescimento de células epiteliais. Os métodos incluíram dissociação de tecido através da incubação com enzimas, tais como a colagenase e dispase, o que em última instância conduzem à excrescência de células de fibroblastos primárias misturadas 6. Estas condições também ser limitada no tempo na manutenção da cultura de células epiteliais. Mínima para nenhum nicho de células epiteliais que formam, como as células epiteliais entraria apoptose devido àa falta de factores de crescimento adequados ou perda de integridade de contacto, denominado anokis 7. O advento do sistema de cultura 3D-organ�de tem proporcionado um método para células intestinais primárias de cultura contendo um espectro de tipos de células intestinais em cultura sustentada 1. Estes Organóides epiteliais tem vantagens em relação a linhas de células, sendo que elas são compostas por várias células diferenciadas, e melhor imitar o órgão de que são derivados a partir de 8 in vivo. O processo para, finalmente, "crescer um mini intestino em um prato de" provou ser uma ferramenta valiosa para a avaliação da resposta do epitélio intestinal, sob diferentes estímulos. Investigar a interacção de células intestinais primárias com padrões moleculares de agentes patogénicos microbianos associados (PAMPs) é relevante para o campo da imunologia como estes padrões moleculares pode regular diversas respostas de cada máquina e micróbio 9. Não só pode investigadores agora explorar estas interações com Organóides rato, mas elespodem ser cultivadas a partir de seres humanos bem como dois. Esta tecnologia tem o potencial de alterar drasticamente a medicina personalizada e é tentador especular sobre os avanços que esta técnica vai tornar possível no futuro próximo.
O objectivo geral do presente método é o de proporcionar um protocolo para a cultura, a expansão, e no tratamento de Organóides intestinais com uma variedade de estímulos. Tais estímulos podem, em última análise variam de vacinas, PAMPs bacterianos, patógenos vivos, gastrintestinal (GI) e cancro terapêutica. O isolamento e cultura de rato Organóides intestinais foi adaptado de Sato et al. Embora existam pequenos desvios do método original, o produto final sendo organ�de cultura ainda é alcançada quando seguindo este protocolo. Este método é focado em descrever uma técnica adequada para a normalização adequada quando se trabalha com estruturas celulares não homogéneos, que devem ser levados em consideração na condução de um ensaio baseado em células number.
Protocol
Representative Results
Discussion
A cultura e manutenção de Organóides intestinais é um procedimento que pode ser dominada por qualquer indivíduo com a técnica de cultura de tecidos adequados. Existem subtilezas em Passaging quando comparadas com células em crescimento em monocamada de um mais convencional, mas estes subtilezas não são difíceis de ultrapassar. Os passos críticos deste método envolvem ser capaz de crescer as Organóides a uma densidade suficientemente elevada para propagação óptima. As experiências devem ser escalados par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
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