Il<em> Ex Vivo</em> Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi
Summary
Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.
Abstract
organoidi intestinali primarie sono un modello di sistema di valore che ha il potenziale per avere un impatto significativo nel campo delle mucose immunologia. Tuttavia, la complessità delle caratteristiche di crescita organoide portano avvertimenti significativi per l'investigatore. In particolare, i modelli di crescita di ogni singolo organoide sono molto variabili e creano una popolazione eterogenea di cellule epiteliali in coltura. Con tali limitazioni pratiche coltura tissutale comune non possono essere semplicemente applicate al sistema organoide a causa della complessità della struttura cellulare. Conteggio e placcatura basato esclusivamente sul numero di cellule, che è comune a cellule separate individualmente, quali le linee cellulari, non è un metodo affidabile per organoidi se viene applicata una tecnica di normalizzazione. Normalizzazione al contenuto totale di proteine è fatta complessa a causa della matrice proteica residente. Queste caratteristiche in termini di numero di cellule, forma e tipo di cellula dovrebbero essere presi in considerazione quando si valuta con secretotende dalla massa organoide. Questo protocollo è stato generato per delineare una procedura semplice per la cultura e il trattamento di piccoli organoidi intestinale con agenti patogeni microbici e pamp (PAMPs). Si sottolinea, inoltre, le tecniche di normalizzazione che dovrebbero essere applicate quando l'analisi delle proteine sono condotte dopo una tale sfida.
Introduction
La capacità di raccogliere e organoidi coltura primaria sono stati descritti per intestino tenue, colon, pancreas, fegato e cervello e sono progressi entusiasmanti germano per comprendere un fenomeno fisiologicamente più rappresentativo per la biologia dei tessuti 1-5. I primi metodi che descrivono la cultura e la manutenzione di piccoli organoidi intestinale è stata riportata da Sato et al. Fuori dal laboratorio di Hans Clevers 1. Prima di questo metodo, la raccolta e la coltura di cellule epiteliali intestinali primarie ha dimostrato di essere limitato e inefficace nel sostenere la crescita delle cellule epiteliali. Metodi incluse dissociazione del tessuto tramite incubazione con enzimi, come collagenasi e dispasi, che finirebbe per portare alla conseguenza di fibroblasti primari mescolati 6. Queste condizioni potrebbero anche essere il momento limitati a sostenere la coltura delle cellule epiteliali. Minimo a nessun nicchia delle cellule epiteliali possano costituire, come le cellule epiteliali sarebbero entrati a causa di apoptosila mancanza di fattori di crescita appropriati o perdita di integrità contatto, definito anokis 7. L'avvento del sistema di coltura 3D-organoide ha fornito un metodo per cellule intestinali primarie coltura contenenti una gamma di tipi di cellule intestinali in coltura sostenuta 1. Questi organoidi epiteliali presentano vantaggi rispetto alle linee cellulari è che essi sono composti da diverse cellule differenziate, e meglio imitano l'organo che sono derivati da 8 in vivo. Il processo di definitiva "crescere un mini budello in un piatto" ha dimostrato di essere un valido strumento per valutare la risposta di epitelio intestinale sotto diversi stimoli. Indagare l'interazione delle cellule intestinali primarie con modelli patogeni microbici associati molecolari (PAMPs) è rilevante per il campo dell'immunologia come questi modelli molecolari in grado di regolare diverse risposte sia da host e microbo 9. Non solo è possibile investigatori ora esplorare queste interazioni con organoidi del mouse, ma hannopuò essere colta da esseri umani come ben 2. Questa tecnologia ha il potenziale per alterare radicalmente la medicina personalizzata e si è tentati di speculare sui progressi che questa tecnica renderà possibile in un prossimo futuro.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo per la coltura, l'espansione e il trattamento di organoidi intestinali con una varietà di stimoli. Tali stimoli possono infine variare da vaccini, PAMPs batteriche, agenti patogeni dal vivo, gastrointestinale (GI) e cancro terapeutica. L'isolamento e la coltura di topo organoidi intestinali è stato adattato da Sato et al. Anche se ci sono lievi deviazioni dal metodo originale, il prodotto finale è organoide cultura è ancora raggiunto quando si segue questo protocollo. Questo metodo è focalizzato sulla descrizione una tecnica adeguata per una corretta normalizzazione quando si lavora con strutture cellulari non omogenei, che devono essere presi in considerazione quando condurre un saggio basato su cellule nterra d'ombra.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cultura e la manutenzione di organoidi intestinali è una procedura che può essere masterizzato da qualsiasi persona con la tecnica di coltura tissutale adeguata. Ci sono sottigliezze in passaging rispetto a crescere le cellule in un monostrato più convenzionale, ma queste sottigliezze non sono difficili da superare. I passaggi critici di questo metodo comporta poter far crescere le organoidi ad una densità sufficientemente elevata per la semina ottimale. Gli esperimenti devono essere ridimensionati con organoidi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
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