le<em> Ex Vivo</em> Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites
Summary
Ici, un protocole pour récolter, conserver et traiter les souris petits organites intestinaux avec des motifs de pathogènes associés moléculaires (PAMP) et Listeria monocytogenes est décrit, ainsi que l' accent sur l' expression des gènes et des techniques de normalisation appropriées pour la protéine.
Abstract
organites intestinales primaires sont un système modèle précieux qui a le potentiel d'impact significatif sur le domaine de l'immunologie des muqueuses. Cependant, la complexité des caractéristiques de croissance organoïdes portent des mises en garde importantes pour l'enquêteur. Plus précisément, les motifs de chaque individu organoïde de croissance sont très variables et à créer une population hétérogène de cellules épithéliales en culture. Avec de telles mises en garde, les pratiques de culture de tissu commun ne peuvent pas être simplement appliquées au système organoide en raison de la complexité de la structure cellulaire. Comptage et placage basée uniquement sur le nombre de cellules, ce qui est courant pour les cellules séparées individuellement, telles que des lignées cellulaires, ne sont pas une méthode fiable pour organites sauf si une technique de normalisation est appliquée. Normaliser à teneur totale en protéines est rendue complexe en raison de la matrice protéique résident. Ces caractéristiques en termes de nombre de cellules, la forme et le type de cellules devraient être prises en considération lors de l'évaluation con sécrétéetentes de la masse organoide. Ce protocole a été généré pour décrire une procédure simple pour la culture et de traiter les petites organites intestinales avec des agents pathogènes microbiens et des modèles moléculaires de pathogènes associés (PAMP). Il souligne également les techniques de normalisation qui devraient être appliquées lorsque l'analyse des protéines sont effectuées après un tel défi.
Introduction
La capacité de récolte et organites culture primaires ont été décrits pour l' intestin grêle, du côlon, du pancréas, du foie et du cerveau et sont avancées intéressantes germane à la compréhension d' un phénomène plus physiologiquement représentant pour la biologie des tissus 1-5. Les premières méthodes décrivant la culture et l' entretien des petits organites intestinale a été signalée par Sato et al. Du laboratoire de Hans Clevers 1. Avant cette méthode, la récolte et la culture des cellules épithéliales intestinales primaires se sont révélées être limitée et inefficace pour soutenir la croissance des cellules épithéliales. Ces méthodes comprennent la dissociation du tissu par incubation avec des enzymes telles que la collagénase et de la dispase, ce qui conduirait finalement à l'excroissance de cellules de fibroblastes primaires entremêlées 6. Ces conditions seraient également limitée dans le temps dans le maintien de la culture cellulaire épithéliale. Minimal à aucune niche de cellules épithéliales formeraient, comme les cellules épithéliales entreraient en raison de l'apoptosel'absence de facteurs ou de perte d'intégrité de contact croissance appropriés, appelé anokis 7. L'avènement du système de culture en 3D organoïde a fourni une méthode pour la culture des cellules intestinales primaires contenant un spectre de types de cellules intestinales en culture prolongée 1. Ces organites epitheliales ont des avantages sur les lignées de cellules étant qu'elles sont composées de plusieurs cellules différenciées, et mieux mimer l'organe qu'ils dérivent de 8 in vivo. Le processus pour finalement "pousser un mini intestin dans un plat" est avéré être un outil précieux pour évaluer la réponse de l'épithélium intestinal sous différents stimuli. Étude de l'interaction des cellules intestinales primaires avec des motifs microbiens pathogènes associés moléculaires (PAMP) est pertinente pour le domaine de l' immunologie que ces motifs moléculaires peuvent réguler les réponses diverses à la fois hôte et microbe 9. Non seulement les chercheurs peuvent explorer maintenant ces interactions avec les organites de la souris, mais ilspeut être cultivé à partir de l' homme ainsi 2. Cette technologie a le potentiel de modifier radicalement la médecine personnalisée et il est tentant de spéculer sur les progrès que cette technique rendra possible dans un avenir proche.
Le but global de ce procédé est de fournir un protocole pour la culture, l'expansion et le traitement des organites intestinaux avec une variété de stimuli. Ces stimuli peuvent finalement aller de vaccins, PAMP bactériens, des agents pathogènes vivants, gastro-intestinal (GI) et la thérapeutique du cancer. L'isolement et la culture des organites intestinale de souris a été adapté de Sato et al. Bien qu'il existe de légères déviations par rapport à la méthode originale, le produit final étant organoide culture est toujours atteint en suivant ce protocole. Cette méthode se concentre sur la description d'une technique adéquate pour la normalisation appropriée lorsque l'on travaille avec des structures de cellules non-homogènes, qui doivent être prises en considération lors de la conduite d'un essai basé sur la cellule nombre.
Protocol
Representative Results
Discussion
La culture et l'entretien des organites intestinale est une procédure qui peut être maîtrisé par un individu avec la technique de culture de tissu adéquat. Il existe des nuances dans des passages par rapport aux cellules cultivées dans un monocouche plus classique, mais ces nuances ne sont pas difficiles à surmonter. Les étapes essentielles de cette méthode impliquent d'être en mesure de cultiver les organites à une densité suffisante pour l'ensemencement optimal. Les expériences doivent être r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
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