ה<em> Ex Vivo</em> גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids
Summary
כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.
Abstract
organoids מעיים הראשי הוא מערכת מודל ערך כי יש הפוטנציאל להשפיע על השדה משמעותי האימונולוגיה רירית. עם זאת, את המורכבות של מאפייני צמיחת organoid לשאת אזהרות משמעותיות עבור החוקר. באופן ספציפי, את דפוסי הצמיחה של כל organoid הבודד הם משתנים מאוד וליצור אוכלוסייה הטרוגנית של תאים אפיתל בתרבות. עם אזהרות כאלה, שיטות בתרבית רקמה משותפת לא יכולות להיות מיושמות פשוט למערכת organoid בשל המורכבות של המבנה התאי. ספירת ציפוי מבוסס אך ורק על מספר תא, אשר נפוץ תאים מופרדים בנפרד, כגון שורות תאים, אינה שיטה אמינה organoids אלא טכניקת נורמליזציה כמה מוחלת. נירמול לתוכן חלבון כולל עשוי מורכב בשל מטריקס חלבון התושב. מאפיינים אלה במונחים של תא מספר, צורה וסוג התא צריכים להילקח בחשבון בעת הערכת con המופרשאוהלים מן המונית organoid. פרוטוקול זה נוצר להתוות תהליך פשוט לתרבות ולטפל organoids מעי דק עם פתוגנים חיידקים ודפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs). זה גם מדגיש את טכניקות הנורמליזציה כי צריך להיות מיושמות כאשר ניתוח חלבון נערך אחרי תיקול כזה.
Introduction
היכולת לקצור organoids עיקרי התרבות תואר עבור מעי דק, מעי גס, לבלב, כבד ומוח והם התקדמות מרגשת רלוונטית להבנת תופעות נציג יותר פיסיולוגי לביולוגית רקמות 1-5. השיטות הראשונות מתארות את התרבות ותחזוקה של organoids מעי הדק נמסרו על ידי סאטו et al. מחוץ למעבדה של נס Clevers 1. לפני זה שיטה, קציר והתרבות של תאים אפיתל במעי העיקרי הוכיחו להיות מוגבל ולא יעיל בשמירת צמיחת תאי אפיתל. טכניקות אלה היו דיסוציאציה של רקמות באמצעות דגירה עם אנזימים, כגון collagenase ו dispase, שיובילו בסופו של דבר אל התולדה של תאי פיברובלסטים העיקריים intermixed 6. תנאים אלו גם להיות מוגבלים בזמן בשמירה על תרבית תאי אפיתל. מינימל ללא נישת תא אפיתל יהווה כמו התאים אפיתל ייכנסו אפופטוזיס בשלחוסר גורמים או אובדן צמיחה המתאימים של שלמות מגע, כינת 7 anokis. הופעתו של מערכת התרבות 3D-organoid ספקה שיטה לתאי מעי עיקריים תרבות המכילים מגוון של סוגי תאי מעי בתרבות מתמשכת 1. יש organoids אפיתל אלו יתרונות על פני שורות תאים להיות שהם מורכבים של תאים מובחנים מספר, וטוב יותר לחקות את האיבר הם נגזרים in vivo 8. התהליך בסופו של דבר "לגדל בטן מינית בצלחת" הוכיחה להיות כלי רב ערך להערכת התגובה של אפיתל מעי תחת לגירויים שונים. חוקר את האינטראקציה של תאי מעי עיקריים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן חיידקים (PAMPs) רלוונטי בתחום האימונולוגיה דפוסים המולקולריים אלה יכולים לווסת תגובות מגוונות משני מארח חיידק 9. לא רק חוקרים יכולים כעת לחקור את יחסי הגומלין הללו עם organoids עכבר, אבל הםיכול להיות מתורבת מבני אדם, כמו גם 2. טכנולוגיה זו יש פוטנציאל לשנות באופן דרמטי רפואה אישית וזה מפתה להעלות השערות לגבי ההתקדמות כי טכניקה זו תאפשר בעתיד הקרוב.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק פרוטוקול לתרבות, הרחבה, וטיפול organoids מעיים עם מגוון רחב של גירויים. גירויים כאלה בסופו של דבר יכול לנוע בין חיסונים, PAMPs בקטריאלי, פתוגנים חי, העיכול (GI) ו בריפוי הסרטן. הבידוד והתרבות של organoids עכבר המעיים הותאמו מ סאטו et al. למרות שקיימות סטיות קלות המשייטת המקורית, המוצר הסופי להיות organoid התרבות עדיין מושג כאשר בעקבות פרוטוקול זה. שיטה זו מתמקדת בתיאור טכניקה נאותה לנורמליזציה ראויה כשעובד עם מבנים של תאים הלא-הומוגנית, אשר חייב להילקח בחשבון כאשר מבצעים assay מבוסס על תא nחוּם אֲדַמדַם.
Protocol
Representative Results
Discussion
התרבות והתחזוקה של organoids מעיים היא הליך זה ניתן לשלוט על ידי כל אדם עם טכניקה בתרבית רקמה נאותה. יש דקויות ב passaging בהשוואה לגידול תאים בשכבה קונבנציונלית יותר, אבל הדקויות הללו אינן שקשה להתגבר עליו. השלבים הקריטיים של שיטה זו כרוך יכולת לגדל את organoids צפיפות גבוהה מספי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. . Culture of epithelial cells. 2nd edn. , (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
