Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen
Summary
Der Entwurf und die Entwicklung eines Aptamers-Gold-Nanoteilchen kolorimetrischen Assay für den Nachweis kleiner Moleküle für in-the-Feldanwendungen untersucht. Zusätzlich wird ein Smart-Gerät farbmetrische Anwendung (App) wurde validiert und langfristige Lagerung des Tests wurde für den Einsatz auf dem Gebiet etabliert.
Abstract
Der Entwurf und die Entwicklung eines Aptamers-gold-Nanopartikel (AuNP) kolorimetrischer Assay zum Nachweis von kleinen Molekülen für Im-Feld-Anwendungen untersucht. Ziel selektive AuNP basierte Farb Assays wurden in kontrollierten Proof-of-Concept-Labor-Einstellungen entwickelt. Allerdings haben diese Systeme, die nicht auf einen Punkt des Scheiterns ausgeübt worden, um ihre praktische Anwendung über Labor-Einstellungen zu bestimmen. Diese Arbeit beschreibt einen generischen Ansatz zu entwerfen, zu entwickeln und zu beheben ein Aptamer-AuNP kolorimetrischen Test für kleine Molekül Analyten und mit dem Test für in-the-Feldeinstellungen. Der Test ist vorteilhaft, da adsorbiert Aptamere die Nanopartikeloberflächen zu passivieren und ein Mittel, zu reduzieren und falsch-positive Reaktionen auf Nicht-Ziel Analyten zu beseitigen. Transitioning dieses System praktische Anwendungen erforderlich definieren nicht nur die Haltbarkeit des Aptamers-AuNP Assay, aber Methoden und Verfahren zur Festlegung für die Langzeitlagerung capabil verlaufkeiten. Auch eine der anerkannten Bedenken kolorimetrische Anzeige ist die Belastung für Analysten platziert genau oft subtile Veränderungen in Farbe zu identifizieren. Zur Verringerung wurde die Verantwortung auf Analysten auf dem Feld, eine Farbanalyse-Protokoll entwickelt, um die Farbidentifikationsaufgaben, ohne die Notwendigkeit zur Durchführung dieser Aufgabe auf Laborqualität Ausrüstung durchzuführen. Das Verfahren zum Erzeugen und Testen der Datenanalyse-Protokoll beschrieben. Jedoch zu verstehen und das Design von adsorbiertem Aptamer-Assays beeinflussen, assoziiert die Interaktionen mit dem Aptamer, Ziel- und AuNPs bedürfen weiterer Untersuchungen. Die gewonnenen Erkenntnisse können dazu führen, Aptamere für eine verbesserte Funktionalität zu zuzuschneiden.
Introduction
Kolorimetrie ist eines der ältesten in der analytischen Chemie verwendeten Techniken. Für diese Technik wird eine qualitative oder quantitative Bestimmung des Analyten auf der Herstellung einer farbigen Verbindung 1 , hergestellt basiert. Typischerweise Farb Assays verwenden Reagentien, die eine Farbverschiebung in der Gegenwart der Analyt-Spezies auftreten, die im sichtbaren Lichtspektrum in einer beobachtbaren oder nachweisbare Farbänderung ergibt. Kolorimetrie wurde in der Detektion von Zielen von Atomen, Ionen und kleine Moleküle , um komplexe biologische Moleküle wie Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Peptide und Proteine im Bereich von 2-4 verwendet. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Nanomaterialien auf dem Gebiet der Nachweisassays revolutioniert, insbesondere mit Farbbasierten Assays 5-6. Kombination hat zur Wiederaufleben führte die einzigartige chemische und physikalische Eigenschaften von Nanomaterialien mit einem Ziel-selektiven Erkennungselement, wie beispielsweise Antikörper, Aptamere Oligonukleotid oder Peptid Aptamere in das Design und die Entwicklung von kolorimetrischen Nachweisassays 7.
Metall-Nanopartikel haben eine nachgewiesene größenabhängige Farbänderung Eigenschaft, die bei der Gestaltung von zahlreichen farbmetrischen Assays genutzt wurde. Gold – Nanopartikel (AuNPs) sind von besonderem Interesse aufgrund einer markanten roten zu blauen Farbverschiebung, wenn die verteilte Lösung von Partikeln induziert wird 8 zu aggregieren, in der Regel durch die genaue Zugabe von Salz. Die Fähigkeit , den Übergang von der dispergierten (rot) zu steuern , um die aggregierten (blau) Zustände hat 2-4,9 für ionische, kleine molekulare, Peptid, Protein und zelluläre Ziele zur Schaffung von kolorimetrischen Sensoren geführt. Viele dieser Sensoren verwenden Aptamere als Zielerkennungsmotiv.
Aptamere sind DNA oder Ribonukleinsäure (RNA) Moleküle , die aus einem zufälligen Pool von 10 ausgewählten 12 -10 15 verschiedene Sequenzen 10-11. Der Auswahlprozess identifiziert Ziel reKognition Elemente mit Bindungsaffinitäten im niedrigen nanomolaren Regime und die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ist die am häufigsten bekannte Verfahren 12-13. Vorteile von Oligonukleotid basierend Aptamere für Sensoranwendungen schließen die Leichtigkeit der Synthese, steuerbare chemische Modifikation und chemischer Stabilität 14-15.
Ein Ansatz, ein kolorimetrischer Test zur Schaffung kombiniert Nanomaterialien mit Erkennungselementen, besteht aus der Kombination dieser zwei Arten durch die physikalische Adsorption von DNA-Aptamer-Moleküle zu AuNP Oberflächen. Durch ziel Aptamerbindung erfährt das Aptamer eine strukturelle Veränderung 16-18, die die Interaktion des Aptamer mit der AuNP Oberfläche verändert, was zu einem induzierbaren rot nach blau mit dem Zusatz von Salz 19 Farbwiedergabe führt. Diese erstaunliche Eigenschaft AuNPs stellt eine beobachtbare kolorimetrischen Antwortmechanismus für Aptamer-basierte Geräte, die verwendet werden können, um deunterzeichnen kolorimetrische Assays für verschiedene Analyten.
Farbtests unter Verwendung von nicht-kovalente entworfen, physikalisch adsorbiert DNA-Aptameren auf AuNP Oberflächen haben das Stigma einer schwachen Sensorplattform ist aufgrund von Problemen mit Robustheit, eine Neigung zum Versagen außerhalb von kontrollierten Laboreinstellungen und den Mangel an Informationen für den Einsatz in der Praxis Einstellungen. Jedoch war die Aptamer-AuNP basierten kolorimetrischen Assay von Interesse wegen der Einfachheit des Betriebs und der beobachtbaren Farbreaktion. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein Protokoll für den Entwurf, die Entwicklung, den Betrieb, Reduzierung der Oberflächen falsch positive Reaktion im Zusammenhang zu liefern, und die langfristige Speicherung von DNA-AuNP basierten farbmetrischen Assays Kokain als Vertreter Analyten verwendet wird. Darüber hinaus haben wir vorgeschlagen , diese adsorbiert Aptamer – Assay – Ansatz (Abbildung 1) als vorteilhaft ist aufgrund der Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit , die in weniger Schritten als der herkömmliche Ansatz für diese Aptamer-AuNP ass geführtege. Für diesen Test wurde das Aptamer zuerst den AuNPs hinzugefügt, die für einen längeren Zeitraum an die Oberfläche adsorbieren gelassen wurden. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes war die Verringerung des Ansprechens auf die Nicht-Ziel Analytmoleküle bezogen auf AuNP Oberflächen-Wechselwirkungen. Jedoch war die Verringerung falsch positiver Reaktion auf Kosten der Empfindlichkeit des Assays. Daher ist eine Balance zwischen den Oberflächenschutz und Analyt Zugänglichkeit ist notwendig, geeignete Testfunktion aufrecht zu erhalten. Außerdem bedeutet ein großer Fehler zu analysieren Farbtests durch andere als mit Instrumentierung ist, dass die Ergebnisse sind oft subjektiv und auslegungs von Analyst-to-Analyst, vor allem wenn man versucht, feine Unterschiede in der Farbe zu unterscheiden. Umgekehrt gibt es eine Reihe von Problemen mit der Herstellung Labor basierte Instrumente verwendbar außerhalb des Labors, wie die Verfügbarkeit von Leistung, Funktionalität mit der Portabilität sind, usw. In dieser Arbeit wurde ein Farbanalyse – Protokoll wurde für mor entwickelte Portabilität und mit Farbe basierten Assay Interpretation 20-21 verbunden sind einige der Vermutungen häufig zu beseitigen. Im Vergleich zu früheren Ansätzen, strebte diese Bemühung, diese Tests, um ihre Grenzen zu gehen für Anwendungen, die über Labor-Einstellungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Laufe der letzten zehn Jahre Nanopartikel basierend kolorimetrischen Assays 2-4 zum Nachweis von Targets umfassen kleine Moleküle, DNA, Proteine und Zellen entwickelt worden. Die Tests, die DNA-Aptamere mit Nanopartikeln verwenden wurden gewinnen Interesse. Typischerweise werden diese kolorimetrische Assays durch Mischen der DNA-Aptamer mit Analytmoleküle durch Zugabe zu AuNPs 9-10 gefolgt durchgeführt. Allerdings haben diese Tests wurden in Proof-of-Concept-Demonstrationen mit kontroll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
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