Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d'oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field
Summary
La progettazione e lo sviluppo di un saggio colorimetrico nanoparticelle aptameri oro per il rilevamento di piccole molecole per applicazioni sul campo è stata esaminata. Inoltre, una smart-dispositivo di applicazione colorimetrico (app) è stato convalidato e conservazione a lungo termine del test è stata stabilita per l'uso nel campo.
Abstract
La progettazione e lo sviluppo di una nanoparticella aptameri oro (AUNP) saggio colorimetrico per la rilevazione di piccole molecole per applicazioni sul campo è stata esaminata. saggi di colore a base di destinazione AUNP selettivo sono stati sviluppati in laboratorio proof-of-concept controllati. Tuttavia, questi sistemi non sono stati esercitato ad un punto di errore per determinare il loro uso pratico oltre impostazioni di laboratorio. Questo lavoro descrive un approccio generico per progettare, sviluppare e risolvere i problemi di un saggio colorimetrico aptameri-AUNP per piccole analiti molecola e con il saggio per le impostazioni in-the-field. Il saggio è vantaggioso perché aptameri adsorbiti passivazione delle superfici nanoparticelle e forniscono un mezzo per ridurre ed eliminare le risposte positive falsi per analiti non bersaglio. Transizione questo sistema per usi pratici necessario definire non solo la shelf-life del test aptameri AUNP, ma che fissa i metodi e le procedure per estendere l'capabil conservazione a lungo terminevità. Inoltre, una delle preoccupazioni riconosciuti con lettura colorimetrica è l'onere che gli analisti a identificare con precisione i cambiamenti spesso sottili di colore. Per diminuire la responsabilità analisti nel settore, un protocollo di analisi del colore è stato progettato per eseguire le funzioni di identificazione del colore senza la necessità di eseguire questa operazione su attrezzature di laboratorio di grado. Il metodo per la creazione e test del protocollo di analisi dei dati è descritto. Tuttavia, per capire e influenzare la progettazione di test aptamer adsorbite, le interazioni associate al aptamer, bersaglio, e AuNPs richiedono ulteriori studi. Le conoscenze acquisite potrebbe portare a sartoria aptameri per una migliore funzionalità.
Introduction
Colorimetria è una delle tecniche più antiche utilizzate in chimica analitica. Per questa tecnica, una determinazione qualitativa o quantitativa dell'analita viene effettuata in base alla produzione di un composto colorato 1. Tipicamente, saggi colori utilizzano reagenti che subiscono un cambiamento di colore in presenza della specie analiti, che si traduce in una variazione di colore osservabile o rilevabile nello spettro della luce visibile. Colorimetria è stato utilizzato nella rilevazione di bersagli che vanno da atomi, ioni e piccole molecole alle molecole biologiche complesse come gli acidi nucleici (DNA), peptidi e proteine 2-4. Negli ultimi due decenni, i nanomateriali hanno rivoluzionato il campo di test di rilevazione, in particolare con test basati colore 5-6. Combinando le proprietà chimiche e fisiche uniche di nanomateriali con un elemento di destinazione di riconoscimento selettivo, come gli anticorpi, aptameri oligonucleotide o aptameri peptidici, ha portato alla recrudescenza in la progettazione e lo sviluppo di test di rilevazione colorimetrici 7.
nanoparticelle metalliche hanno una proprietà viraggio dipendente dalle dimensioni dimostrato, che è stato sfruttato nella progettazione di numerosi test colorimetrici. Nanoparticelle di oro (AuNPs) sono di particolare interesse per uno specifico spostamento di colore rosso al blu, quando la soluzione dispersa di particelle è indotta ad aggregare 8, tipicamente attraverso la precisa aggiunta di sale. La capacità di controllare la transizione dalla disperso (rosso) alle (blu) stati aggregati ha portato alla creazione di sensori colorimetrici per ionica, piccolo molecolare, peptidi, proteine e bersagli cellulari 2-4,9. Molti di questi sensori impiegano aptameri come il motivo di puntamento.
Aptameri sono molecole di acido ribonucleico (RNA) DNA o selezionati da un pool casuale di 10 12 -10 15 diverse sequenze 10-11. Il processo di selezione individua re bersaglioElementi cognizione con affinità di legame nel regime bassa nanomolari, e l'evoluzione sistematica dei ligandi per arricchimento esponenziale (SELEX) è il processo più comunemente noto 12-13. I vantaggi di aptameri a base di oligonucleotidi per applicazioni di rilevamento sono la facilità di sintesi, modifica chimica controllabile, e stabilità chimica 14-15.
Un approccio per la creazione di un saggio colorimetrico combina nanomateriali con elementi di riconoscimento, consiste nel combinare queste due specie attraverso l'adsorbimento fisico di molecole di DNA-aptamer alle superfici AUNP. Attraverso obiettivo vincolante-aptamer, l'aptamero sperimenta un cambiamento strutturale 16-18 che altera l'interazione del aptamer con la superficie AUNP, che porta ad una risposta inducibile colore rosso-to-blu 19 con l'aggiunta di sale. Questa caratteristica sorprendente di AuNPs fornisce un meccanismo di risposta colorimetrica osservabile per i dispositivi aptamer-based che possono essere utilizzati per defirmare test colorimetrici per i diversi analiti.
saggi di colore progettati utilizzando non covalenti, fisicamente assorbiti aptameri di DNA su superfici AUNP hanno lo stigma di essere una piattaforma sensore debole a causa di problemi con la robustezza, una propensione per il fallimento di fuori di impostazioni di laboratorio controllate, e la mancanza di informazioni disponibili per l'uso in pratica impostazioni. Tuttavia, il saggio colorimetrico basato aptameri AUNP era di interesse per la semplicità di funzionamento e risposta cromatica osservabile. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la progettazione, lo sviluppo, il funzionamento, la riduzione della superficie correlata risposta falso positivo, e la conservazione a lungo termine di DNA-AUNP test colorimetrici basati uso di cocaina come l'analita rappresentante. Inoltre, abbiamo proposto questo adsorbito aptamer approccio test (figura 1) come vantaggioso per la semplicità e facilità d'uso che ha provocato meno passaggi rispetto all'approccio convenzionale per questi aptameri AUNP assAYS. Per questo test, l'aptamero è stato aggiunto ai AuNPs, che era permesso assorbire alla superficie per un periodo prolungato di tempo. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è la riduzione della risposta non bersaglio nuove molecole legate alle interazioni di superficie AUNP. Tuttavia, la riduzione in risposta falsi positivi a scapito della sensibilità del test. Quindi un equilibrio tra la protezione superficiale e analita accessibilità è necessario mantenere una corretta funzione test. Inoltre, un grave difetto di analisi saggi colore attraverso mezzi diversi con strumentazione è che i risultati sono spesso soggettivi e aperto all'interpretazione da analista-a-analista, soprattutto quando si cerca di distinguere sottili differenze di colore. Al contrario, ci sono una serie di problemi con fare strumentazione basata laboratorio utilizzabile al di fuori del laboratorio, come la disponibilità di energia, la praticità con la portabilità, ecc In questo lavoro, un protocollo di analisi del colore è stato sviluppato per More la portabilità e per eliminare alcune delle congetture comunemente associati con l'interpretazione del test basato colore 20-21. Rispetto ai precedenti approcci, questo sforzo è sforzato di spingere questi test ai loro limiti per applicazioni al di là delle impostazioni di laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi dieci anni, nanoparticelle basato test colorimetrici sono stati sviluppati per la rivelazione di bersagli includono piccole molecole, DNA, proteine e cellule 2-4. Assays che utilizzano DNA aptameri con nanoparticelle sono state guadagnando interesse. Tipicamente, questi test colorimetrici vengono eseguite mescolando il DNA-aptamer con nuove molecole seguita da aggiunta a AuNPs 9-10. Tuttavia, questi test sono stati utilizzati in proof-of-concept dimostrazioni con le impostazioni …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
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